Aislamiento de Acidos Nucleicos: Fagos

1. Aislamiento de Acidos Nucleicos:Fagos Aníbal Valentín, PhD, JA Cardé, PhD Biol 4207 – Lab Virología y Biotecnología Universidad de Puerto Rico, Aguadilla

2. Objetivos • Aplicar el métodos de aislamiento de ácidos nucleicos con fenol/cloroformo para extracción de DNA de fagos. • Describir las funciones de las diferentes soluciones utilizada en las técnicas de aislamiento de ácidos nucleicos. • Realizar una extracción de DNA fago M13 utilizando los método de fenol - cloroformo. 

3. Introducción • Los ácidos nucleicos y las proteínas se encuentran bajo estudio constantemente. • Los problemas asociados con el estudio de estas son particulares y únicos para cada uno: DNA, RNA, proteínas • Nos centraremos en el estudio de las técnicas de aislamiento de ácidos nucleicos.

4. Lísis • El rompimiento o lísis celular es el primer paso para obtener el DNA genómico. • Varias técnicas son utilizados para provocar lísis celular. • Entre ellas se encuentran: • lisis hipotónica • lisis enzimática.

5. Métodos: Lisis Hipotónica • Se utiliza una solución hipotónica que causa la hinchazón de la célula y el rompimiento de la membrana plasmática y/o de la pared celular. • Junto a las sales se pueden añadir detergentes, que ayudan a degradar los  lípidos de la membrana. (Detergentes no iónicos, i.e. Tween 20 y Triton X-100, utilizados con células de mamíferos y detergentes iónicos i.e. SDS para células con pared celular o cutícula externa que la protege) 

6. Métodos: Lisis Enzimática • Se utilizan las mismas soluciones y detergentes anteriormente mencionados además de enzimas que catalizan la reacción. • La función principal de la enzima es la degradación de los peptidoglicanos presentes en la pared celular. • Entre las enzimas utilizadas en esta técnica se encuentran lisozima y proteinasa K.   

7. Métodos: Extracción Fenólica Posterior a la lísis se realiza una extracción fenólica. Utilizada para remover proteínas que se encuentran contaminando el DNA. El fenol y/o cloroformo no se mezclan con el agua formando fases separadas cuando se tratan de mezclar. Cuando la solución acuosa de DNA se mezcla con fenol y/o cloroformo, las proteínas se mueven a la fase orgánica, formada por el fenol y/o cloroformo, dejando así el DNA en la fase acuosa. La fase acuosa con el DNA se remueve y el DNA es precipitado utilizando etanol y sales.

8. Extracción Fenólica

9. Materiales

10. Protocolo • Colectar ~500uL del medio que contiene el M13 aislado del plug de agar. • 1. Añadir 500uL de phenol/cloroformo/alcohol isoamílico saturado con Tris • 2. Mezclar bien/vortex por 30 segundos • 3. Centrifugar a 12,000rpm por 5 min • 4. Recolectar la fase acuosa (~450uL) y transferir a un microtubo • 5. Proceder con la precipitación por isopropanol • 6. Separar la muestra anterior en 2 microtubos (~200uL c/u) • 7. Añadir 1/10 parte del volumen de 3M Acetato de Sodio, pH 4.8

11. Protocolo • 8. Mezclar bien • 9. Añadir 0.7X el volumen de 100% isopropanol (frío) ~160uL • 10. Centrifugar a 12,000rpm por 30min a 4oC • 11. Descartar el sobrenadante mediante inversión prestando atención al “pellet” de ácido nucleico. • 12. Añadir 1mL de 70% etanol • 13. Centrifugar a 12,000rpm por 10min a 4oC

12. Protocolo • 14. Descartar el sobrenadante mediante inversión prestando atención al “pellet” de ácido nucleico. • Si es necesario, una vez descartado el 70% etanol, volver a centrifugar por 30 segundos a 12,000 y remover los residuos de etanol utilizando un micropipeta sin perturbar el pellet • 15. Incubar el microtubo que contiene el ácido nucleico a temperatura ambiente y abierto durante 10-15min • Permitir que los residuos de etanol se evaporen • 16. Resuspender el ácido nucleico en 25uL de agua destilada • 17. Guardar a -20oC

13. Preguntas • Para que es el fenol? • Para que es el cloroformo? • Para que es el alcohol isoamilico? • Para que es el Acetato?   • Para que es el isopropanol? • Para que es el etanol? • Para que es el agua?

14. Virtual Labs • DNA Extraction • Plant DNA Extraction