1 / 37

Imunohistochemie (IHC)

Imunohistochemie (IHC). IHC. principy imunohistochemie. princip imuno- metod = vazba molekul imunoglobulinů (Ig) s jinými molekulami.

isha
Download Presentation

Imunohistochemie (IHC)

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Imunohistochemie (IHC)

  2. IHC principy imunohistochemie

  3. princip imuno- metod = vazba molekul imunoglobulinů (Ig) s jinými molekulami

  4. imunohistochemie (ihc): všechny techniky využívající mono-či polyklonální značené protilátky (Ab), kterými lokalizujeme a vizualizujeme příslušné tkáň. antigeny (Ag) • vztah klíče (Ab, volná) a zámku (Ag, tkáň. Ag)

  5. základní typy ihc metod • přímá: primární Ab značená přímo • nepřímá dvojstupňová: imunologická vazba sekundární značené Ab na Ab primární • nepřímá trojstupňová: např. streptavidin-biotin-komplex (SABC)

  6. ad 1) přímá metoda • primární Ab značená přímo • nutná dostatečná koncentrace hledaného Ag ve tkáni • nativní řezy (pro parafín málo citlivé)

  7. ad 2) nepřímá dvojstupňová • komplikovanější na přípravu x citlivější • první „vrstva“: neoznačená Ab (Ig nebo sérum) specifická pro hledaný tkáň. Ag = primární Ab • druhá „vrstva“: značená Ab proti Fc fragmentu primární protilátky = sekundární Ab, vazba imunologická

  8. ad 3) nepřímá trojstupňová • amplifikační = zesílení signálu při malém množství molekul Ag ve tkáni • primární specifické antisérum proti Ag prokazovanému ve tkáni • neznačená specifická Ab proti primární = spojovací = můstek • značený komplex streptavidinbiotin(SABC)

  9. typy Ab • polyklonální: • mnoho aktivovaných klonů B lymfocytů proti různým oblastem určitého Ag nebo proti směsi Ag • vysoká senzitivita x nízká specifita • monoklonální: • 1 klon • nízká senzitivita x vysoká specifita

  10. značení Ab • fluorescenční značky • enzymy: např. peroxidáza

  11. obecné schéma ihc protokolu • odběr a fixace tkáně • krájení a napínání řezů • optimalizace prezentace Ag • blok aktivity endogenních enzymů • blok pozadí

  12. obecné schéma ihc protokolu • vazba primární Ab • vazba sekundární Ab • detekční systém • demaskování komplexu Ag-Ab • barvení pozadí (buň. jader) • dehydratace a montáž preparátu

  13. ad 1) odběr a fixace • pro ihc skloubení zachování morfologie x zachování antigenicity a minimalizace artefaktů • průkaz Ag nutno in situ (v místě norma výskytu ve tkáni • během fixace artefakty • fixace pufrovaným neutrálním formalínem

  14. ad 2) krájení a napínání • napnutí na kapce vody • skla potažená lepivou hmotou • bílek-glycerin • želatina • poly L-lysin • APES (3-amino-propyl-triethoxysilan) • účinná a trvanlivá! (var v MT, lázni)

  15. ad 3) optimalizace prezentace Ag • lepší fixace x horší prokazatelnost tkáň. Ag • ošetření tkáň. řezů, aby povrchy lépe „nabízely“ Ag = regenerace Ag (Ag retriever) • snižují přilnavost k povrchům

  16. ad 3) optimalizace prezentace Ag • použití proteáz • MT • vodní lázeň

  17. ad 4) blok endogenní aktivity enzymů • pro průkaz vazby Ag-Ab běžně použití Ab značených enzymem (peroxidáza…) • přirozený výskyt ve tkáni – falešně pozitivní výsledky reakcí

  18. ad 4) blok endogenní aktivity enzymů • blok endogenní peroxidázy! • 1-3% H2O2 v methanolu nebo destil. H2O po dobu 20 – 30 min • blokování avidinu a biotinu (ledviny a játra) • blok s 0,1 – 0,01% avidin v PBS 20 min a následně blok 0,01 – 0,001% biotinem v PBS 20 min

  19. ad 5) blok pozadí • nespec. reakce pozadí – falešná pozitivita • falešně pozit. nespecifická reakce pozadí: • aktivita endogenních tkáň. enzymů (vysycení enzymů jejich substrátem) • endogenní avidin-biotinová reakce (endogenní biotin: játra, ledviny, tuk. tkáň., mléčná žláza) • kontaminace řezů nebo reagencií cizorod. látkami

  20. ad 5) blok pozadí • křížové reakce (zkřížená reaktivita) Ab s podobnými epitopy na různých Ag • nespecif. vazba primární Ab na kolagen, laminin, elastin, proteoglykany, keratin, tuk. tkáň a jiné pojiv. struktury (důsledek fixace aldehydy) • nespecif. vazby v důsledku elektrostat. interakcí • poškození řezu (vyschnutí!)

  21. ad 5) blok pozadí • difúze tkáň. Ag do okolí • nespec. reakce sekundární, popř. terciární Ab s Fc receptory imunoglobulinů ve tkáni (cytoplazmat. membrány, často makrofágy a granulocyty) • Ag pohlcen makrofágy • nekróza tkáně (vylití cytoplazmat. obsahu do mezibuň. prostoru)

  22. ad 5) blok pozadí • nespecifickému vychytávání spec. Ab předcházíme vysycením tkáně bílkovinami (nespec. sérem nebo mlékem) – tkáň se saturuje „neškodnými“ bílkovinami a nespec. přibarvování pozadí je menší

  23. ad 6-8) vazba Ab a detekčního systému • reakce tkáň. Ag s primární – sekundární – terciární Ab = přítomnost chromogenu v místě, kde došlo ke spec. vazbě • reakce Ag-Ab nejlépe při neutrálním pH • příbalový leták spec. Ab (fixovaná x zmražená tkáň, doporučené ředění…)

  24. ad 9) vizualizace komplexu Ag-Ab, chromogeny • vazba Ag-Ab bez viditelné reakce! • pro využití světel. mikroskopu nutno vizualizovat = použití chromogenů • imunofluorescenční • imunoenzymové: peroxidáza • produkt činnosti peroxidázy je nerozpustný pigment

  25. ad 9) vizualizace komplexu Ag-Ab, chromogeny • enzymatická reakce = vhodné podmínky (optimální teplota, pH, iont. síla roztoku, poměr mezi enzymem a substrátem, nepřítomnost inhibitorů…) • peroxidáza + DAB = stabilní hnědý produkt, nerozpustný v alkoholu (nevyplaví se při dehydrataci řezů)

  26. ad 10) dobarvování pozadí • orientace v preparátu – dobarvení jader hematoxylinem

More Related