Les techniques de la biologie moléculaire

1. Les techniques de la biologie moléculaire

2. Introduction

3. "Chercher une aiguille dans une meule de foin" ? • Chercher à repérer un gène particulier dans un génome entier, qui en contient jusqu'à des centaines de milliers, c'est un peu comme chercher une aiguille dans une meule de foin...

4. La réponse a ce problème : Les techniques de la biologie moléculaire

5. L’électrophorèse

7. L’électrophorèse des acides nucléiques • Déplacements de fragments d’acides nucléiques chargés selon leur taille sur un gel soumis a un champ électrique

8. Le gel utilisé L’agarose pour les fragments d’ADN de taille (0,5-20kb) L’acrylamide pour les fragments de moins de 1000 paires de base

9. L’électrophorèse en champs alternées Principe • On change périodiquement l’orientation du champ par a port au gel ,lors du changement de l’orientation du champ électrique l’acide nucléique change le sens de son orientation .

12. Visualisation par autoradiographie

13. But Séparer, analyser ou purifier des acides nucléiques

14. Remarque • Les fragments d’acides nucléiques peuvent être séparer selon leur structure ;par exemple les différents formes d’un plasmide (ouvert ,linéaire ,surenroulé)

16. Remarque • Elle permet aussi d’étudier des interactions des acides nucléiques avec des protéines

17. La centrifugation

18. Centrifugation en gradient de saccharose • Principe: Séparer les macromolécules selon leur poids moléculaire et/ou leur forme

19. Utilisations majeurs • Purification des phages • Sélection des fragments d’ADN voulus • Isolement des polysomes • Fractionner les ARN (ARNm, ARNt,…)

20. Un exemple d'utilisation de la centrifugation zonale : le fractionnement de molécules d'ARN

22. Centrifugation en gradient de chlorure de césium • /Centrifugation isopycnique (gradient continu) Utilisation d’une: Solution de chlorure de césium(CsCl)

23. Utilisations majeurs • Préparation de plasmides et de phages Exemple: La purification des plasmides

25. 2/ .Centrifugation sur coussin (gradient discontinu) 

26. Utilisation majeure • préparation rapide et à grande échelle des phages ou des virus de densité connue.

27. Un exemple d'utilisation de la centrifugation sur coussin : la purification des phages

29. La PCR

30. Historique • En 1960 dans les sources de Yellowstone aux U.S.A. « Thermus aquaticus » est découverte vivant à 70°C, trente ans plus tard son ADNpoly <Taq > est utilisée dans la PCR • (La revue Sciences décernait sa 1ere distinction de molécule de l’année à la Taq polymérase)

31. Définition • PCR « polymérase chain reaction ») technique d’amplification in vitro mis au point par le chimiste Kary MULLIS en 1985 ( Prix Nobel 1993)

32. Principe Faire progresser nos capacité d’analyse des gènes

33. Composés utilisés • L’ADN matrice • Amorces d’oligonucléotides • Une ADN polymérase • Des désoxyribonucléotides triphosphate (dNTP)

34. Déroulement des cycles d’amplification • La dénaturation • L’appariement des primers • Elongation Schéma de la PCR 

36. Applications La PCR a apportée d’importantes contributions dans beaucoup de domaines: • Les maladies héréditaires • La recherche contre le cancer • Les sciences médico-légales • Les biotechnologies

37. L’hybridation

38. Complémentarité des bases successives de l’ADN La réversibilité du processus de séparations deux brins d’ADN Généralités Les techniques de l’hybridation reposent sur :

39. Les cas possibles pour une hybridation • Hybridation stable (100%) • Pas d’hybridation • Hybridation partielle (50%)

40. But Repérer une molécule d’ADN ou d’ARN spécifique dans une population hétérogène

41. Les différentes techniques d’hybridation • Hybridation ADN/ADN : Southern blotting • Hybridation ARN/ADN : Northern blotting • Hybridation Dot-blotting et slot-blotting

42. Southern • Sonde ADN • Cible ADN (nucléaire, phagique plasmidique ou autres,…)

43. Northern • Sonde ADN • Cible ARN

44. Dot-blotting & Slot-blotting • Sonde ADN • Cible ARN ou ADN Monocaténaire

45. Conclusion • Grace aux techniques de la biologie moléculaire les chercheurs ont pu établir une partie de la carte des gènes humains, et espèrent obtenir le séquençage de tous le génome humain a des fins thérapeutique, médicales, a titre de prévention

46. Référence • *Cours de l’institut national de recherche pédagogique • *Biologie moléculaire PCEM 1 2006-2007 Université de Paris –VI Faculté de Médecine Pierre et Marie Curie • *Comprendre la biologie moléculaire V. Laudenbach’, (2), J. Mantz(1), J.M. Desmontsl(1) (1) ‘Département d’anesthésie-réanimation chirurgicale, hôpitaux Bichat-Claude Bernard-Robert Paris ; • (2)Laboratoire de neurologie du développement Paris • * Thèse de Licence d’informatique Année 2001-2002 Option : Introduction à la biologie moléculaire • *Principes des techniques de biologie moléculaire 2° édition Par D. Tagu, C.Moussard, éds (I.N.R.A. de Paris) • *Article du magazine La recherche édition spéciale < Les frontières du vivant > N°317 Février 1999 • * Participation à l’établissement d’une phylogénie moléculaire de requins d’eau profonde de l’ordre des Squaliformes de L’Université de Nantes Département Sciences et Techniques Alimentaires Marines • *L’essentiel en génétique Edition : BERTI • *Biochimie génétique biologie moléculaire de Jacqueline Etienne & Eric Clauser Edition Masson • *Principe de génie génétique 6° édition ; édition De Boeck