1 / 85

BIOTEHNOLOĢIJA III : REKOMBINANTU BIOTEHNOLOĢIJA

BIOTEHNOLOĢIJA III : REKOMBINANTU BIOTEHNOLOĢIJA. JAUNĀ BIOTEHNOLOĢIJA. I. Muižnieks, 2013. g. raf A promotera fragmenta fūtprints ar norādītajiem proteīniem. Vai var atrast represora un CAP proteīna saistīšanās vietas, noteikt to sekvences ?. SVEŠA PROTEĪNA EKSPRESIJA BAKTĒRIJĀS

jeneil
Download Presentation

BIOTEHNOLOĢIJA III : REKOMBINANTU BIOTEHNOLOĢIJA

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. BIOTEHNOLOĢIJA III : REKOMBINANTU BIOTEHNOLOĢIJA JAUNĀ BIOTEHNOLOĢIJA I. Muižnieks, 2013. g.

  2. rafA promotera fragmenta fūtprints ar norādītajiem proteīniem. Vai var atrast represora un CAP proteīna saistīšanās vietas, noteikt to sekvences ?

  3. SVEŠA PROTEĪNA EKSPRESIJA BAKTĒRIJĀS REPORTIERGĒNI: b-galaktozidāze; b-glikuronidāze; CAT; luciferīn luciferāze; GFP. DNS TOPOLOĢIJA UN ĢEOMETRIJA SEKVENCES ATKARĪGA DNS LIEKŠANA liekto segmentu veidošanās modeļi; liekto DNS segmentu lokalizācija DNS SUPERSPIRALIZĀCIJA plazmīdu DNS superspiralizācijas modeļi; plazmīdu superspiralizācijas blīvuma noteikšana SUPERSPIRALIZĀCIJAS LOMA PLAZMĪDU FUNKCIJĀSreplikācijas un struktūras stabilitātes saistība; ekspresijas regulācija; rekombinācijas regulācija

  4. REPORTIERGĒNI

  5. REPORTIERGĒNI

  6. b galaktozidāze

  7. b galaktozidāze 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- beta-D-galactopyranoside

  8. b galaktozidāze

  9. b glukuronidāze

  10. b glukuronidāze 5-bromo-4-chloro-3-indolyl glucuronide (X-Gluc) 4-methylumbelliferyl-beta-D-glucuronide (MUG)

  11. b glukuronidāze Rice anthers and style showing GUS expression

  12. CAT ANTIBIOTIKAS: DARBĪBAS PRINCIPS, INAKTIVĀCIJA Hloramfenikols, levomicetīns Proteīnu sintēze, struktūras, modifikācija, acetiltransferāze

  13. CAT

  14. CAT

  15. Luciferāze

  16. Luciferāze

  17. GFP Medūza Aequorea victoria no ZA rietumkrasta ūdeņiem

  18. GFP GFP veido viens 238 aminoskābes garš polipeptīds. Tā ir kausam līdzīga trešējā struktūra, kuras iekšienē 65., 66. un 67. aminoskābes veido UV un zilo gaismu absorbējošu centru, kas rada zaļu fluorescenci.

  19. GFP

  20. GFP The Nobel Prize in Chemistry 2008for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP Osamu Shimomura Martin Chalfie Roger Y. Tsien

  21. GFP

  22. DNSĢEOMETRIJA SEKVENCES ATKARĪGA DNS STRUKTŪRAS LIEKŠANA

  23. DNS konformācija: A; B; Z formas

  24. DNS elementu ģeometrija koordnātes slīpums = tip pacēlums = inclination atvērums = opening propellera pagrieziens propeller twist ieliekums = buckle R.E. Dickerson et al. (1989) Nucleic Acids Res. 17, 1797-1803.

  25. DNS elementu ģeometrija vērpe = twist W sagāzums = rollt savērsums = tiltP Secīgo bāzu pāru mijiedarbības enerģija – stacking energy Persistences garums – polimera elastīguma mērs: attālums, ārpus kura robežām nav iespējams prognozēt polimēra ass orientācijas izmaiņas. DNS persistences garums ~ 50 nm jeb ~ 150 b.p.

  26. SEKVENCES ATKARĪGA DNS STRUKTŪRAS LIEKŠANA

  27. Leishmania un citas tripanosomas satur vienu mitohondriju, kurā atrodams liels daudzums mitohondriālās jeb t.s. kinetoplasta DNS. http://dna.kdna.ucla.edu/parasite_course-old/kdna/subchapters/kdna1.htm

  28. SEKVENCES ATKARĪGA DNS STRUKTŪRAS LIEKŠANA Liekti DNS fragmenti PAAG elektroforēzē kustas lēnāk nekā tikpat gari taisni fragmenti

  29. SEKVENCES ATKARĪGA DNS STRUKTŪRAS LIEKŠANA Liektās DNS struktūras veidošanās modeļi

  30. SEKVENCES ATKARĪGA DNS STRUKTŪRAS LIEKŠANA Liektās DNS struktūras veidošanās modeļi Estimation of wedge components in curved DNA L.E.Ulanovsky, E.N.Trifonov Nature, 326, 720, 1987

  31. SEKVENCES ATKARĪGA DNS STRUKTŪRAS LIEKŠANA Liekto DNS segmentu kartēšana

  32. SEKVENCES ATKARĪGA DNS STRUKTŪRAS LIEKŠANA Liekto DNS segmentu kartēšana

  33. SEKVENCES ATKARĪGA DNS STRUKTŪRAS LIEKŠANA Liekto DNS segmentu kartēšana • Ad2 E2a late 364 • Ad2 E2a late 490 • Ad2 E2a late 220 • Ad2 VAI 226 • AluI elem. 412 • IS1dim 768 • IS5’ dim 548 • IS10 • TNFprom. 615 • Ret prom 375 • rafP 170

  34. SEKVENCES ATKARĪGA DNS STRUKTŪRAS LIEKŠANA Liekto DNS segmentu kartēšana

  35. SEQUENCE DEPENDENT DNA CURVATURE COMPUTER MODELING OF THE BENT DNA STRUCTURE

  36. SEKVENCES ATKARĪGA DNS STRUKTŪRAS LIEKŠANA Liekto DNS segmentu kartēšana Curved regions in pBR322, as determined by electron microscopy; Muzard G. et al. EMBO J., 9, 1289, 1990 Salīdzinošā pBR322 DNS liekšanas intensitāte; O/bp. Twister 2.0 datormodelis

  37. PLAZMĪDU TOPOLOĢIJA DNS SPIRĀLES UN SUPERSPIRĀLES: Savītā (plektonomiskā) superspiralizācija Apvītā (toroīdā) superspiralizācija

  38. Plektonēmiska superspiralizācija - Vinograd J, Lebowitz J, Radloff R, Watson R, Laipis P The twisted circular form of polyoma viral DNA. Proc Natl Acad Sci U S A 1965 May;53(5):1104-11

  39. PLAZMĪDU TOPOLOĢIJA Plazmīdu molekulas ir plektonēmiski superspiralizētas

  40. PLAZMĪDU TOPOLOĢIJA Topoloģiski noslēgtu plazmīdas DNS raksturo nemainīgs sasitības skaitlis (linking number, Lk), kuru veido DNS pavedienu savstarpējais krustošanos raksturojoša DNS vijumu skaitļa (twist, Tw) un DNS dubultspirālu savstarpējo krustošanos raksturojoša vērpes skaiļa (wright, Wr) summa: Lk = Tw + Wr

  41. PLAZMĪDU TOPOLOĢIJA Lk0 ir fizioloģiskos apstākļos pilnīgi relaksētas plazmīdas molekulas saistības skaitlis. Superspiralizācijas stāvokli raksturo saistības skaitļa starpība DLk. Fizioloģiskos apstākļos baktēriju šūnā plazmīdu DNS ir negatīvi superspiralizēta: DLk < Lk0 t.i. DNS spirāles solis ir garāks, DNS ir daļēji atritināta

  42. PLAZMĪDU TOPOLOĢIJA Izmaiņas plazmīdu DNS topoloģijā rada enzīmi – topoizomerāzes, topoloģijas izmaiņas var radīt arī lokālu DNS denaturēšanos

  43. SUPERSPIRALIZĀCIJU raksturo saistības skaitlis (linking number: Lk = Tw + Wr)un superspiralizācijas blīvums (supercoling density :  = Lk / Lk0)

  44. Superspiralizācija šūnā tiek regulēta

  45. PLAZMĪDU TOPOLOĢIJA Superspiralizācijas regulācijā piedalās divu tipu enzīmi: (1) I tipa topoizomerāzes: pārrauj vienu pavedienu (“nicking-closing" enzīmi), D Lk = ± 1. (2) II tipa topoizomerāzes: pārrauj abus pavedienus, D Lk = ± 2. E.coli pie pirmā tipa topoizomerāzēm pieder topoizomerāze I and topoizomerāze III, kuras parasti realksē DNS, samazinot negatīvās superspiralizācijas blīvumu. E.coli pie otrā tipa topoizomerāzēm pieder DNS topoizomerāze II jeb DNS girāze, tā plielina negatīvās superspiralizācijas blīvumu. Eikariotu šūnās tāpat ir divas pirmā un viena otrā tipa topoizomerāzes, visas nodarbojas ar superspiralizācijas blīvuma (gan pozitīvā, gan negatīvā) samazināšanu.

  46. Superspiralizācijas blīvums mainās: • replikācijas laikā; • transkripcijas laikā; • rekombinācijā; • baktēriju kultūrai novecojot; • vides stresa apstākļos; • mutagēnu iedarbībā

  47. Interkalējošie savienojumi ietekmē superspiralizāciju. EtBr molekulas iespiešanās starp DNS bāzu pāru plaknēm samazina rotācijas leņķi starp tām par ~ 26o

  48. Interkalējoši savienojumi vispirms atritina negatīvi superspiralizētu DNS, pēc tam ievieš pozitīvus superspirāles vijumus Pozitīvas supersiralizācijas gadījumā DNS attālums strap DNS bāzu pāru plaknēm samazinās

  49. Superspiralizācijas blīvumu var novērtēt elektroforēzē interkalējošo savienojumu klātbūtnē

  50. Plazmīdu superspiralizācijas izmaiņas baktēriju kultūras augšanas laikā

More Related