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Metodi in Neuroscienze II

Metodi in Neuroscienze II. In base a ciò che ci si prefigge di studiare diventa molto importante la scelta del preparato (modello animale e/o cellulare) e del suo grado di complessità . Cervello isolato. Cervello intero isolato di porcellino d’india. Studi effettuati: - anatomici

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Metodi in Neuroscienze II

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Presentation Transcript

  1. Metodi in Neuroscienze II

  2. In base a ciò che ci si prefigge di studiare diventa molto importante la scelta del preparato (modello animale e/o cellulare) e del suo grado di complessità

  3. Cervello isolato

  4. Cervello intero isolato di porcellino d’india

  5. Studi effettuati: - anatomici - immunoistochimici - vascolari - farmacologici - elettrofisiologici Vantaggi rispetto alla slice: - Circuiti corticali interamente preservati Svantaggi: - possibilità di registrare artefatti - registrazioni intra- ed extracellulari ma solo in current-clamp

  6. 50 µm Esempi di probes a multielettrodi utilizzati per la registrazione contemporanea da diversi strati di tessuto Probe al silicio a 32 canali Probe al silicio a 16 canali 750 µm 1550 µm

  7. Registrazione dalla corteccia con un probe multielectrode

  8. Slices Sezione di cervelletto

  9. Preparazione di una slice di ippocampo

  10. Registrazioni Extra- ed Intracellulari in una Slice di Ippocampo elettrodo di registr. intracellulare elettrodo di registr. extracellulare stimolo stimolo

  11. Whole-cell Patch Clamp in slice o fettina di tessuto sottile

  12. Neuroni isolati • Dissociazione acuta di neuroni da tessuto adulto o embrionale • Colture primarie (da embrione) Vantaggi rispetto alla slice: Soprattuto per indagini elettrofisiologiche - migliori voltage- e space-clamp; - migliore farmacologia; - possibilità di mantenere le cellule in coltura per giorni;

  13. vantaggi Biologia Molecolare • Biologia Molecolare • Clonaggio ed espressione di geni • Mutagenesi sito-diretta • Biochimica • Elettrofisiologia Transfez. Plasmide + cDNA NG108-15 SHSY-5Y HEK Elettofisiologia whole-cell & single-chann. Clone esprimente stabilmente il gene transfettato Linee cellulari stabilizzate di origine neuronale e non

  14. Molte informazioni sul meccanismo di funzionamento dei canali ionici sono il risultato di una collaborazione tra elettrofisiologi e biologi molecolari Supponiamo per esempio di voler testare l’ipotesi che una particolare catena laterale della proteina-canale sia implicata nel processo di apertura/chiusura.

  15. Gene (DNA) Ipotesi circa una importante catena laterale Vengono mutati i codons desiderati o cDNA RNA Viene fatta “esprimere” la proteina con una catena laterale alterata misura Mutagenesi Sito-Diretta sul Canale Ionico

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