METABOLISMO DO NITROGÊNIO

1. METABOLISMO DO NITROGÊNIO

2. INTRODUÇÃO Nutrição mineral: solução do solo.   macronutrientes : N , P, K, Ca, Mg, S. micronutrientes : B, Cl, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo, (Co). O N é de grande importância para as plantas: AA, Proteínas, Enzimas, Ács.Nucléicos (RNA, DNA), Clorofilas etc... Fonte de N: 1.  Ar (solo): N2 (plantas fixadoras) 2.  solução do solo: NO3- e NH4+

3. Ureídeos SOLO Bactérias Rhizobium Oxidação Oxidação Nitrosomonas Nitrobacter Nitrificação O CICLO DO NITROGÊNIO Fixação Biológica ou Simbiótica Fixação Não Simbiótica Desnitrificação N2, NO2,N2O N2 N2 Amonificação Absorção NH3/NH4+ NO2- NO3- Lixiviação Lençol Freático

4. Amonificação: Liberação de NH4+ para o meio ambiente. Nitrificação: formação de NO3- por ação de bactérias. 2 NH3 + 3 O22 NO2- + 2 H+ + 2 H2O NITROSSOMONAS 2 NO2- + O22 NO3- NITROBACTER

6. ABSORÇÃO DE NITRATO • Existe um sistema de EFLUXO e INFLUXO.

7. Em cevada o sistema de influxo de 13NO3- apresenta modelo típico da cinética de Michaelis-Menten. O influxo depende do nível de nitrato (tratamento prévio) e o sistema de transporte de nitrato é induzido por nitrato e do TIPO COTRANSPORTE ANTIPORT – NO3-/ H+

8. REDUÇÃO DO NITRATO O nitrato é reduzido a amônia/amônio (NH3/NH4+) por dois processos catalíticos:  • A)   REDUTASE DO NITRATO. • B)   REDUTASE DO NITRITO. Esta redução pode ocorrer na raiz e/ou folha, dependendo da espécie, idade e suprimento de NO3-. 

9.     NO CITOSOL RN NO3- + 2 H+ + 2 e- NO2- + H2O. NO CLOROPLASTO OU PLASTÍDEO RNi  NO2- + 8 H+ + 6 e- NH4+ + 2 H2O

11. REDUTASE DO NITRATO (RN) É dependente de NADH É formada de duas sub-unidades de 110-115 KDa de massa molecular, com grupo prostético FAD, Heme(Fe), citocromo b557 e cofator Mo. Os elétrons passam: NADH FAD CIT b557 MoCo NO3- A enzima pode conter reações parciais: redução do CIT, cujo papel fisiológico não é claro.

12. A localização: no CITOSOL e pode estar próxima a membrana do cloroplasto durante o tempo de redução (facilita o rápido transporte de NO2- para dentro do cloroplasto, pois é um composto altamente tóxico).

13. LANÇADEIRAS – FORMAÇÃO DO NADH MITOCONDRIAL CLOROPLASTIDIAL

15. REDUTASE DO NITRITO (RNi) É uma enzima dependente de FERREDOXINA (FD). É formada de uma sub-unidade de 60-64 KDa de massa molecular e contém siro-heme como grupo prostético (4Fe-4S) no seu sítio ativo. Localização: cloroplastos

16. ASSIMILAÇÃO DA AMÔNIA GLUTAMINA SINTETASE (GS) Enzima responsável pela assimilação do NH4+(NH3), o qual é incorporado na forma orgânica pela aminação do 2-oxoglutarado catalisado pela glutamato desidrogenase e/ou pela produção do 2-oxoglutarato do ciclo de Krebs. A catálise da GS é dependente de ATP para converter Glu em Gln (Km 3-5 M) e está presente em todos os tecidos das plantas.

17. Porta de entrada da amônia para a formação dos aminoácidos em plantas superiores. É uma proteína octamérica com massa molecular de 350-400 KDa, com 12 sub-unidade. Níveis altos de GS têm sido isolados de nódulos de leguminosas que fixam nitrogênio (feijão isoenzimas GSn1 e GSn2) Localização: CITOSOL (GS1) e CLOROPASTOS (GS2) ou PLASTÍDIOS.

18. ATP ADP + Pi Mg+2 GLUTAMATO + NH3 GLUTAMINA

19. GLUTAMATO SINTASE (GOGAT) É a enzima responsável pela transferência do grupo amida da Gln para o 2-Oxoglutarato para produzir 2 moléculas de glutamato (Glu). Duas diferentes formas de GOGAT estão presentes em plantas superiores Utiliza a Ferredoxina reduzida (FD) como fonte de poder redutor (FD dependente) 1.   - Está presente em altas concentrações nas folhas e está localizada nos cloroplastos

20. Utiliza o NADH (NADH dependente) • 1.  Está presente em baixas concentrações nas folhas, mas tem um grande papel na fixação do N2 pelos nódulos (apresenta massa molecular de 200 KDa ) • 2. Está localizada nos plastídios de nódulos de Phaseolus • 2H NH2 NH2 GLUTAMINA + 2-Oxoglutarato 2 Glu Glu-sintase(GOGAT) NH2

21. AMINOTRANSFERASES OU TRANSAMINASES Aspartato amino transferase Glu + Oxaloacetato  2-Oxoglutarato + Aspartato Alanina amino transferase Glu + piruvato  2-Oxoglutarato + alanina

22. Obs. • 1.Os dois oxoglutaratos formados por essas vias podem retornar ao ciclo GS/GOGAT. • 2.As aminotransferases têm sido detectadas em plantas que podem sintetizar todos os aminoácidos (exceto prolina). • 3.Desse modo, o NITROGÊNIO pode ser facilmente distribuído a partir do Glutamato, via Aspartato e Alanina, para todos os aminoácidos. • 4.A aspartato aminotransferase pode estar envolvida no transporte do poder redutor (NADH, NADPH) da mitocôndria e cloroplasto para dentro do citosol, os NADH produzidos serão utilizados na redução do nitrato ou na redução do hidroxipiruvato no peroxisomo.

24. ARMAZENAMENTO E TRANSPORTE DE NITROGÊNIO Há ocasiões em que as plantas necessitam transportar o nitrogênio de um órgão para outro: Nódulos para as folhas e fruto. De folhas velhas para folhas jovens e frutos. De cotilétones de sementes em germinação para as partes aéreas em expansão e ponta da raiz.

25. A Asparagina é universalmente usada pelas plantas superiores como um componente de armazenamento e transporte. O N-amida é derivado diretamente do grupo amida da glutamina, sintetizada pela enzima asparagina sintetase. É uma reação dependente de glutamina e ATP. NH2ATP AMP + PpiNH2 Gln + Aspartato-NH2 Glu-NH2 + Asn-NH2 NH2 Asparagina Sintetase

26. Os cotilédones de sementes em germinação são as principais fontes de asparagina sintetase. Essa enzima requer Cl- para a atividade e é inibida na presença de Ca+2.

27. FORMAÇÃO DA AMÔNIA DURANTE O METABOLISMODAS PLANTAS A amônia é formada durante vários processos: 1. Assimilação Inicial: produto da redução do nitrato e fixação de N2. 2.    Fotorrespiração: alta taxa liberada na conversão de Gly  Ser 3.    Metabolismo dos componentes de Transporte: É liberada durante a degradação da Asn, Arg e ureídeos.

28. 4. Reações específicas dos aminoácidos: É liberada durante a conversão da Phe  cinamato (produção de lignina); Cistationina  Homoserina (na síntese da metionina); Treonina  2-oxobutirato (na biossíntese da Isoleucina) 5. Catabolismo de Proteínas: as proteínas são hidrolisadas durante a germinação das sementes e durante a senescência de folhas. Há evidências de que a amônia é formada pela ação da glutamato desidrogenase:

29. Glu + NAD+ + H2O  2-oxoglutarato+NH3 + NADH +H+ GDH

30. FOTOSSÍNTESE E O METABOLISMO DO NITROGÊNIO • O NADPH e o ATP são gerados pelos dois fotossistemas (FS-I e FS-II) e podem ser utilizados para a síntese de outros compostos nitrogenados, tais como AMINOÁCIDOS e LIPÍDIOS.

31. JUSTIFICATIVAS 1. 1. O NO2- pode ser reduzido numa reação dependente da luz nos cloroplastos para formar glutamina e glutamato. • 2.RNi, GS, GOGAT estão localizadas nos cloroplastos. • 3.O caminho da fotorrespiração envolve a síntese de glicina pela transaminação do glioxilato. A NH3 liberada pela reação da Gly  Ser é reassimilada nos cloroplastos.

32. 4.Nas C4, o aspartato, a alanina e o glutamato estão envolvidos no transporte de metabólitos entre células da bainha vascular e células do mesófilo. • 5.A aminotransferase do aspartato: 2-oxoglutarato estão envolvidas em transferir o poder redutor (NADPH) gerado no cloroplasto. 6. Os cloroplastos têm a capacidade de converter o Aspartato  Lisina, Treonina, Isoleucina e Homocisteína em reações dependentes de LUZ. O piruvato  leucina, valina e isoleucina, na sintese de aminoácidos aromáticos.

33. 7.Todas as enzimas ou a maior parte delas necessárias para a síntese dos aminoácidos essenciais: Lisina, Treonina, Isoleucina, Homocisteína, Leucina, Valina, Triptofano, Fenilalanina e Tirosina, localiza-se nos cloroplastos, como também da sintese de arginina e prolina. • 8.Os cloroplastos têm a capacidade de reduzir sulfato de cisteína, e as enzimas envolvidas nos passos metabólicos estão localizadas nos cloroplastos. A redução da gluationa, assim como os mecanismos de desintoxificação de superóxidos são também dependentes da luz.

34. 9.Uma grande quantidade de proteínas(p.ex. subunidades de RUBISCO, ATP-Sintetases e certos citocromos) são codificados pelo DNA cloroplástico e, portanto, dependentes da luz. • 10.Os cloroplastos têm capacidade de sintetizar ácidos graxos, ácidos nucleicos e clorofilas, utilizando NADPH e ATP produzidos diretamente dos dois fotossistemas. • OBS. Em locais não verdes como as raízes, os processos descritos podem ocorrer nos plastídios e a energia é dependente dos açúcares produzidos nas folhas.

36. METABOLISMO DA FIXAÇÃO DO N2 FORMAÇÃO DOS NÓDULOS. 1 – Crescimento dos pêlos radiculares. As raízes exsudam compostos orgânicos, tais como, açúcares, aminoácidos, etc. que irão atrair as bactérias rhizóbia (Quimiotactismo), formando uma “rhizosfera microbiana”. 2 – Os pêlos radiculares eliminam exsudados específicos (flavanóides-antocianinas) para atrair as bactérias para as raízes e induzir especificidade através do gene nod da bactéria (nodulação).

37. 3 – A bactéria Rhizóbia atraca na superfície do pêlo radicular (provavelmente pela proteína específica - LECTINA-glicoproteína). 4 – Em resposta ao sinal da Rhizóbia, o pêlo radicular curva com a mesma grudada. 5 – A bactéria Rhizóbia digere a parede celular e forma o CORDÃO DE INFECÇÃO (forma de tubo) para dentro do córtex da raiz, onde penetram e se multiplicam intensamente, ocorrendo também intensa divisão celular das células corticais que se exteriorizam, formando o NÓDULO

43. Início da formação de nódulo radicular em uma planta leguminosa.

44. A região da córtex da raiz, com intensa divisão celular, recebe o nome de nódulo primário. • Ao chegar nas proximidades do nódulo primário, o cordão de infecção se ramifica para invadir as células vegetais. • Pequenos grupos de bactérias, contidas no interior de vesículas membranosas, são liberados dentro do citoplasma das células vegetais do nódulo primário. • O citoplasma da célula invadido conterá vários grupos de bactérias, individualizado por uma membrana derivada da membrana do cordão de infecção.

45. 5. A partir desse início de estabelecimento do nódulo radicular, as bactérias, que se encontram dentro das células radiculares hospedeiras, param de se multiplicar, aumentam de tamanho e sofrem várias alterações bioquímicas para se transformarem em bactérias especializadas na fixação de nitrogênio, os bacterióides. 6. Para diferenciar as duas fases da vida desses microrganismos, convencionou-se que o nome bactéria seria utilizado enquanto não ocorressem as transformações bioquímicas que iniciam o processo de fixação de nitrogênio. Portanto, quando os microrganismos passam a fixar nitrogênio são chamados de bacterióides.

46. 7. Os nódulos radiculares desenvolvidos possuem uma organização própria de tecidos. Eles apresentam um meristema responsável pela formação das células da região de invasão, uma região central e conexões vasculares com o xilema do cilindro central da raiz. Envolvendo e delimitando toda essa estrutura está o parênquima do nódulo.

48. A NITROGENASE E A REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE NITROGÊNIO 1. A reação de fixação do nitrogênio caracteriza-se pela redução do N2 à NH3 (NH4+). A NITROGENASE E A REAÇÃO DE FIXAÇÃO DE NITROGÊNIO N2 NH3 (NH4+) Nase

49. 2. Para que a reação ocorra, é necessário que haja um transporte de elétrons, mediado por moléculas aptas a realizá-lo. 3. A enzima nitrogenase é formada por duas unidades protéicas, a Ferro-proteína (Fe-proteína) e a Molibdênio-Ferro-proteína (MoFe-proteína), ambas capazes de transportar elétrons. Durante a reação de redução do N2, a nitrogenase é auxiliada por uma terceira molécula transportadora de elétrons, a ferridoxina. 4. O modelo proposto para a evolução da reação pode ser entendido do seguinte modo:

50. A ferridoxina, na sua forma reduzida, transfere um elétron para a unidade Fe-proteína da nitrogenase. • A Fe-proteína, então reduzida, doa o elétron recebido para a MoFe-proteína. • A MoFe-proteína acumula os elétrons. Após 8 transferências, essa unidade terá acumulado 8 elétrons e, então, fará a redução do N2 à NH3. • Para cada elétron transferido da Fe-proteína para a MoFe-proteína são consumidos 2 ATPs. Para reduzir uma molécula de N2 são necessários 8 (oito) elétrons e, portanto, 16 ATPs.