ÉLESZTŐ GENETIKA ÉS MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA

ÉLESZTŐ GENETIKA ÉS MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA • ASaccharomyces cerevisiaeélesztő: a természetben és alkalmazásai • Más élesztők • Az élesztő eukarióta: az élesztő sejt • Az élesztő szexuális ciklusa és nemi élete • Élesztő genetika: alapok • Élesztő genetika: élesztő törzsek keresztezése • Élesztő genetika: mutáns készítés • Élesztő gének klónozása: vektorok • Élesztő gének klónozása komplementációval • Élesztő gének deléciója • Okos géndeléciók és transzpozon mutagenezis • Tovább: gének/fehérjék • Az élesztőben vizsgált modell rendszerek • Élesztő biotechnológia

Élesztő WWW helyek • http://www.phys.ksu.edu/gene/chapters.html • http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/VL-yeast.html • http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces/yeastlabs.html • http://genome-www.stanford.edu/Saccharomyces

ASaccharomyces cerevisiaeélesztő:a természetben és felhasználása • Az élesztő gyümülcsökön, virágokban és más cukrot tartalmazó helyeken él • Az élesztő igen változatos éghajlati körülményekkel is megbírkózik: • Tűrik fagyponttól ~55°C-iga hőmérsékletet • 12°C-tól 40°C-ig képesek osztódni • pH 2.8-8.0 lehetséges a szaporodásuk • Elviselik a gyakorlatilag teljes kiszáradást (por élesztő) • Az élesztő még képes növekedni és fermentálni 3M-os cukor koncentráción (nagy ozmózis nyomás) • 20% alkohol koncentrációt még túlél • Saccharomyces cerevisiaemás élesztők mellet a borkészítés fő organizmusa (mert fermentációs kapacitása nagy és jól tűri a kis pH-t és a nagy etanol koncentrációt) • Saccharomyces cerevisiae (carlsbergensis)a sörélesztő, mert még oxigén jelenlétében is alkohollá fermentálja a cukrokat, a lager élesztő 8°C-on is fermentál • Saccharomyces cerevisiaea pékélesztő is, cukrokból gyorsan készít széndioxidot • Saccharomyces cerevisiae- vel termeltetnek sok értékes fehérjét, mert rekombináns DNS technikákkal jól kezelhető, elismerten biztonságos és fermentációs technológiája nagyon fejlett. • Saccharomyces cerevisiaehasználható drog screening-re és funkcionális analízisre, mert eukarióta és gyakorlatilag olyan könnyen kezelhető, mint a baktériumok. • ASaccharomyces cerevisiaea legfontosasbb eukarióta sejt modell rendszer, mert genetikai és sejtbiológiai vizsgálata hatékony; az eukarióta sejtek sok fontos tulajdonságát élesztőben fedezték fel. • Ezért aS. cerevisiae–t olyan kutatásokban használják, amelyek az élő sejt tulajdonságainak megismerését, a funkciókat működtető mechanizmusok felderítését célozzák, továbbá a már meglévő biotechnológiai eljárások javítását, vagy újak elkészítését szolgálják.

Néhány fontos élesztő • Schizosaccharomyces pombe, a hasadó élesztő, a molekuláris és a sejtbiológia fontos modell organizmusa, néhány fermentációban használják. • Kluyveromyces lactis, a tej élesztő; modell organizmus némi biotechnológiai jelentősséggel alaktóz fermentáció miatt • Candida albicans, nem jó modell, mert nincs szex-ciklus; de vizsgálják, mert humán patogén • Saccharomyces carlsbergensisésSaccharomyces bayanus: aS. cerevisiaeközeli rokonai, sör és bor készítésre használják. • Pichia stipidis, Pichia pastoris, Hansenula polymorpha, Yarrovia lipolyticagenetikai vizsgálata kisebb jelentőségű (speciális tulajdonságok, mint pl. a peroxiszóma biogenezise), fehérje termelő gazdák • Fonalas gombák, a nemzetségek nagy csoportja, mint genetikai modell organizmus, mint pl.Cryptococcus, Aspergillus, Neurospora...., biotechnológiai jelentőség, humán patogének is. A S. cerevisiaeis képes fonalas növekedésre.

ASaccharomyces cerevisiae eukarióta • Ascomyceta gomba • Egysejtű, pszeudohifa képzés képességgel • S. cerevisiaesarjadzással osztódik (hiszen: sarjadzó élesztő), míg a Schizosaccharomyces pombehasadással osztódik (hasadó élesztő) • A sarjadzás két nem azonos méretű sejtet eredményez, egy anya (öreg) és egy leány (új) sejtet. • Az élesztő nem kortalan; a sejtek öregszenek és az anya sejt 30-40 osztódás után elpusztul. • A sejt az eukariótákra jellemző szerkezetű, különböző organellumokkal: - A sejtfal glukánokat, mannánokat és fehérjéket tartalmaz. • Periplazmatikus tér hidrolítikus enzimekkel • Plazma membrán foszfolipid kettősréteggel és sok különböző fehérjével. • Nukleusz nukleolusszal • Vakuolumok mint tároló és hidrolitikus szervecskék • Szekréciós útvonal endoplazmatikus retikulummal, Golgi apparátus és kiválasztó hólyagocskák. • Peroxiszómák az oxidatív degradációhoz • Mitokondriumok a légzéshez Az élesztő sejt kb. 4-7mm nagy. Az alján látható „szemek” a hasadás utáni sebhelyek.

Az élesztők életciklusai Sarjadzó élesztő Hasadó élesztő

Az élesztőnek van szexuális élete! • Az élesztő sejtek haploidként (1n, minden kromoszómából egy kópia) és diploidként (2n, két kópia minden kromoszómából) is tudnak létezni; a 2n sejtek 1,2-szer nagyobbak. • A haploid sejtek a vagy a párosodási típusúak. • Két haploid sejt párosodik és zigótát képez;az élesztő nem tud mozogni, ezért egymás felé kell nőniük (shmoos). • A diploid zigóta a kapcsolódás helyén kezd osztódni. • Nitrogén éheztetésre a diploid sejt meiozison megy át és négy haploid spórát tartalmazó aszkusz képzése közben spórázik. • Ezért bár az élesztő egysejtű, különböző sejt típusokat tudunk megkülönböztetni, különböző genetikai programmal: • Haploid MATaésMATa • Haploid és Diploid (MATa/a ) • Spóra • Anyák és lányok

Élesztő szex! • A szexuális kommunikáció központjában a feromon válasz szignál transzdukciós útvonal van. • Ez egy komplex felépítésű útvonal, ami az a- vagy az alfa-faktorra adott választ szabályozza az élesztő sejtekben. • Ennek az útvonalnak minden eleme, az élesztőtől az emberig, konzerválódott.Az útvonalban van az a- vagy alfa-faktort kötő receptor (a G-fehérjével kapcsolt hét-transzmembrán receptorok osztályába tartozik, mint sok humán hormon receptor).A feromon kötődése a sejthez a sejtet a feromon forrása, a párosodási partner felé irányítja. • A feromon kötődése stimulál egy jelátvivő kaszkádot, az úgynevezett MAP (Mitogen Activated Protein) kinázútvonalat (sok emberi, állati és növényi útvonalhoz hasonlóan). • A jelátvivő útvonal megállítja a sejtciklust, hogy a sejtek felkészülhessenek a párosodásra (a sejteknek szinkronban, a G1 fázisban kell lenni a fúzióhoz).Az útvonal a párosodásban fontos gének megnyilvánulását szabályozza.

Élesztő szex! • Aktus közben: sejt-sejt kapcsolódás, sejt fúzióés sejtmag fúzió elektron mikroszkópi képe. • A haploid sejtek párosodási feromon peptideket készítenek: a- illetve alfa-faktort, amire a párosodási partner válaszként felkészül a párosodásra. • Ez azt jelenti, hogy az eltérő nemű élesztő sejtek genetikailag megkülönböztethetőek, hiszen eltérő gének készlete nyilvánul meg bennük. • Vagyis, olyan haploid specifikus gének, amelyek részt vesznek a feromonra adott válaszban, továbbá azRME1gén, ez a meiózis represszorát kódolja. • Az a-specifikus gének, amelyek az a-faktor termeléséhez kellenek és az alfa-faktor receptor génje. • Az alfa-faktor termeléshez szükséges és az a-faktor receptor gének.

Az élesztő sejt típusának genetikai meghatározottsága • A párosodási típust a III-as kromoszóma MAT lokuszán lévő allél határozza meg. • A párosodási típus lokusz szabályozó fehérjéket kódol, azaz transzkripciós faktorokat. • AMATa lokusz kódolja az a1 transzkripciós aktivátort (az a2 funkciója nem ismert). • AMATalpha lokuszkódolja az alfa1 aktivátortés az alfa2 represszort. • A párosodási típus lokusz mester szabályozó lokuszként működik: sok gén megnyilvánulását szabályozza.

A párosodási típust meghatározó gének expressziója • Az alfa sejtekben az alfa1 aktívátor stimulálja az alfa-specifikus géneket és az alfa2 represszor gátolja az a-specifikus géneket. • Az a sejtekben nem aktíválódnak az alfa-specifikus gének és nem represszálódnak az a-specifikus gének, más, eltérő transzkripciós aktívátort használnak a megnyilvánuláshoz. • A diploid sejtekben az a1/alfa2 heteromer represszor gátolja alfa1 megnyilvánulását és ezért az alfa-specifikus gének csendesek. Az a- és a haploid-specifikus gének szintén represszáltak. • Ilyen haploid-specifikus gén a meiózis represszorát kódolóRMEés bár a diploidokban nem nyilvánul meg; a meiózis és a spórázás programok csak tápanyag limitációra kezdődnek el. • Összegezve, a sejt típust nagyon kevés primer transzkripciós faktor határozza meg, amelyek egyénileg, vagy pedig kombinációban hatnak. • Ez sarkalatos alapelv és a soksejtű organizmusokban is konzerválódott a különböző sejttípusok meghatározásánál: pl. homeotikus gének ( és valóban, az a1 homeobox faktor)

Haploidok és diploidok a természetben és a laborban • A természetben az élesztő sejtek mindig diploidként növekednek, valószínűleg azért, mert javítja túlélési esélyeiket, ha esszenciális génjükben lesz mutáció (mindig van egy másik példány). • Nitrogén éheztetésre a diploid sejt spórázik és később a haploid spóra kicsírázik, már ha minden nélkülözhetetlen génje működőképes. • Ez gyakran azt jelenti, hogy jó ha egy tetrádból egy spóra életképes. • Hogyan lehetünk biztosak, hogy ez az egyetlen spóra talál magának párosodási partnert, hogy újra diploidot képezzenek? A válasz a párosodási típus váltás(mating type switch)! • Az első osztódás után az anya-sejt típust vált és párosodik a leányával, hogy diploidot képezzenek, ami persze homozigóta az összes génjére és a sejtek új klónját jelentik. • Ha a párosodási típus váltható és a diploid a kedveltebb forma, akkor mi szükség van spórázásra és párosodási típus váltásra? • Lehet rá néhány ok: (1) A spórák sokmindent túlélnek (2) A spórázás egy lehetséges módja annak, hogy megszabaduljon a felhalmozódott mutációktól. (3) A meiózis alkalom az allélok új kombinációjának kialakítására, ami előnyösebb lehet, mint a korábbi (4) Néha a sejtek egy másik tetrádból találnak maguknak párt és képeznek egy új klónt, amelyiknek előnyösebb lehet az allél kombinációja • Azért, hogy az élesztővel genetikai vizsgálatokat lehessen végezni és, hogy haploid sejteket lehessen szaporítani a laborban, a párosodási típus váltást meg kell előzni: ezért az összes laboratóriumi törzs HO mutáns és nem tud váltani. • Hogyan is működik ez a szex váltó?

A haploidok képesek párosodási típust váltani! • A párosodási típus váltást két csendes, ugyanazon a kromoszómán lévő párosodási típus lokusz okozza, amelyek akkor válnak aktívvá, ha áthelyeződnek (transzlokálódnak) a MAT lokuszba • A MAT lokusz ezen két kópiájának csendesítését részletesen vizsgálták és vannak a magasabb rendűek sejtjeiben is konzerválodott tulajdonságok: heterokromatin képzés. • A transzlokáció egy a HO nukleáz által kezdeményezett génkonverzió, ez úgy vág mint egy restrikciós enzim a a kromoszómán lévő párosodási típus lokusz közepébe • A laboratóriumi élesztő törzsekből hiányzik a HO nukleáz, ezért stabilan haploid fázisban vannak • Érdekes, hogy csak az anya sejt tud váltani • Ez biztosítja, hogy osztódás után ellentétes típusok legyenek • Ez a szabályozó fehérjék egyenlőtlen öröklődése miatt van • Ez a stratégia konzerválódott és a soksejtű organizmusokban a sejtek differenciálódását okozza (anyai hatás)

Élesztő genetika: az örökítő anyag • AS. cerevisiaesejtmag genomja 16 kromoszómát tartalmaz • Ezen kívül, még van mitokondrium genom és egy plasztid, a 2micron-os plazmid • Az élesztő kromoszómáknak van centromerje és telomerje, amelyek egyszerűbbek, mint a magasabb rendű eukariótáké • A haploid élesztő genom körülbelül 12 500 kbp és 1996-ra teljesen szekvenálták ( ez volt az első eukarióta genom szekvencia)

Élesztő genetika: az örökítő anyag • Az élesztő genom a predikció szerint körülbelül 6 200 gént tartalmaz, annotációjuk még folyamatban van • Számottevő a redundancia, ami egy ősi genom duplikáció következménye • Ez azt jelenti, hogy számos génnek van nagyon közeli homológja, amelyek viszont gyakran másként szabályozódnak • A legextrémebb példa a cukor transzporter géneké, ezekből több mint húsz van • A géneknek durván 1/3-át jellemezték genetikai analízissel, 1/3-uk biokémiai funkciója homológia alapján becsülhető, a maradék harmad nem homológ más génekkel, vagy csak eddig még nem jellemzett génekhez hasonlít • Az élesztő géneknek csak kis hányada tartalmaz intront, nagyon kevésben van egynél több; az intronok térképezése még nincs készen • A gének közötti intergénes szekvenciák csak 200 és 1000 bp között vannak (intergenic space) • A legnagyobb ismert regulátor szekvenciák több mint 2800 bp-ra terjednek ki (MUC1/FLO11)

Élesztő genom analízise • Az élesztőt kutató társaságok közös célja: minden egyes gén funkciójának meghatározása • Ezért néhány nagy program, különböző megközelítési módokkal működik • Micro array analízis: a megnyilvánuló gének szimultán meghatározására • Micro array analízis minden transzkripciós faktor kötőhelyének meghatározására a genomon • Élesztő deléciós analízis: a teljes készlet, több mint 6000 deléciós mutáns van készen • Különböző megközelítésekkel vizsgálják ezeket a mutánsokat • Minden élesztő gént jelöltek a zölden fluoreszkáló fehérjével (GFP), ami lehetővé teszi a fehérje lokalizációjának megállapítását mikroszkópos vizsgálatokkal • Különböző globális fehérje kölcsönhatási vizsgálatok vannak folyamatban

Élesztő genetika: nomenklatúra • Az élesztő gének neve három betűből és legfeljebb három számból áll:GPD1, HSP12, PDC6...Általában elegendő (vagy nem) rövidítések • A vad típusú géneket nagy, dőlt betűkkel írjuk: TPS1, RHO1, CDC28... • A recesszív mutáns géneket kis dőlt betűkkel: tps1, rho1, cdc28 • A mutáns alléleket kötőjel meg egy számmal: tps1-1, rho1-23, cdc28-2 • Ha a mutáció konstruált, pl. gén delécióval, akkor azt is jelöljük, meg a delécióhoz használt genetikai markert is : tps1D::HIS3 • A gén termékét, a fehérjét nagy kezdőbetűvel írjuk és álló betűkkel; gyakran egy „p” betűt teszünk a végére:Tps1p, Rho1p, Cdc28p • Sok gént csak szisztematikus szekvenálással találtak meg és amíg funkciójukat meg nem határozzák, addig csak a helyzetükből adódó nevük van: YDR518C, YML016W..., ahol • Ya ”yeast”-ből jön • A második betű a kromoszómát jelöli (D=IV, M=XIII....) • LvagyRa jobb vagy bal kromoszóma kart jelenti • A három számjegy azt, hogy hányadik ORF a centromertől számítva az adott kromoszóma karon • CvagyWa ”Crick” vagy ”Watson” szálat jelenti, vagyis az ORF irányát • Néhány gén nem ezt a nomenklatúrát követi,amit már ismernek: HO, MATa, MATa

Élesztő genetika: markerek és törzsek • A genetikai bélyegekkel (markerek) követhetjük a kromoszómákat a genetikai keresztezéseknél és szelektálhatjuk a diploidokat. Ezek alapján szelektálhatjuk a transzformánsokat plazmiddal történő transzformáció, vagy a genomba történő gén integráció után • Gyakori genetikai bélyeg az auxotrófia: HIS3, URA3, TRP1, LEU2, LYS2, ADE2 • Azade2 mutáció nagyon hasznos, specifikus tulajdonsága van: a sejtek pirosak lesznek • Az élesztő genetika első markerei fermentációs markerek voltak, vagyis néhány szubsztrát hasznosítását kódoló gének: SUC, MAL, GAL • A SUC gének (SUC1-7) invertázt kódolnak (periplazmás enzim) és különböző élesztő törzsekben különböző kromoszómákra térképeződnek (telomer lokáció) • MALlokuszok (MAL1-6) három gént kódolnak: maltáz, maltóz transzporter és egy transzkripciós aktivátor; szintén telomer lokáció • GAL gének a galaktóz felvételt és a glükóz-6-foszfáttá konvertáló enzimeket kódolják • Mint azE. coli- nál itt is használunk néhány antibiotikum rezisztencia gént transzformácóknál: kanamicin rezisztencia, kanR • Sok élesztő törzset használnak a laboratóriumokban: W303-1A, S288C, S1278b, SK1, BY4741.... • Sajátos tulajdonságaik nagyon különbözhetnek és különböznek a vad, vagy az ipari törzsektől • Egy kedvenc törzs, a W303-1A teljes genotípusa a következő: MATa leu2-3/112 ura3-1 trp1-1 his3-11/15 ade2-1can1-100 GAL SUC2mal0

Élesztő genetika: törzsek keresztezése • Az élesztő genetika azon a lehetőségen alapul, hogy hogy két ellentétes párosítási típusú és eltérő mutációkat hordozó haploid törzset keresztezni lehet és diploid törzset kapunk • A diploid törzset aztán már vizsgálni lehet, hogy például a haploid törzsek mutációja ugyanabban a génben, vagy pedig más génekben van-e • A diploid spóráztatható, tetrádokat képez, a tetrádok mikromanipulátorral szétszedhetők, a spórák különálló telepeket képeznek, amelyek már tovább vizsgálhatók • A múltban rengeteg ilyen keresztezést végeztek, hogy megállapíthassák a gének elhelyezkedését a kromoszómákon: meghatározták a két mutáció rekombinációs gyakoriságát (mindkét mutáció egy spórában, vagy pedig mutáció nélküli spóra), ami a genetikai távolság mérésére alkalmas • A szekvencia meghatározása előtti utolsó géntérkép több mint 1000 gént tartalmazott és nagyon pontosnak bizonyult, ami az élesztő fantasztikus rekombinációs hajlandóságának is köszönhető • Manapság a genetikai keresztezést (genetic cross) új mutánskombinációk elkészítéséhez használják, pl. kettős, háromszoros, négyszeres….. mutánsok, ezért is jó, ha ismerjük a genetikai keresztezések és a gén szegregáció néhány alapelvét • A genom szekvencia ismeretében sem nélkülözhetjük az új mutánsok előállítását és screenelését, például azért, hogy találjunk a már ismert gének mellett újakat is amelyek részt vesznek ugyanabban az útvonalban. Az új mutáns genetikai analízise az első és nélkülözhetetlen lépése a jellemzésnek

Élesztő genetika: törzsek kersztezése • Hogy két törzs kereszteződjön, öszzekeverjük agar táptalajon és hagyjuk, hogy párosodjanak, pl.MATa leu2 URA3 x MATalpha LEU2 ura3 • A diploid sejteket, mert mindkét komplementáló markerre heterozigóták lesznek, leucin és uracil mentes táptalajon szelektálhatjuk • A diploidok spóráztató táptalajon növesztve néhány nap múlva aszkuszokat (tetrád) képeznek • A spórázás nitrogén éhezés mellett indul meg, pl. KAc táptalajon • Az aszkusz fala specifikus enzimmel (pl. csiga gyomorból) emészthető és spórákat mikromanipulátorral elkülöníthetjük agar táptalajon • Csírázás után a spórák telepeket képeznek és egyenként vizsgálhatóak • Ez azt jelenti, hogy a meiózis utáni utódok közvetlenül vizsgálhatók (az egy sejt előnye) • Gyakorlott genetikus már a növekedési erély alapján meg tudja mondani, hogy a mutációk hogyan váltak szét, mert a kettős mutáns gyakran lassabban nő, mint bármelyik egyszeres • Egyébkent meg, a spórákból növekvő telepeket különböző táptalajokra replikázzuk, hogy meghatározhassuk tulajdonságaikat és követhessük a genetikai bélyeget

Élesztő genetika: törzsek keresztezése • A spórák mating típusát úgy határozhatjuk meg, hogy komplementáló markerű teszt törzs pázsitjára replikázzuk, hagyjuk hogy párosodjanak, majd a diploidokat szelektív táptalajra replikázzuk: csak azok nőnek, amelyek párosodtak, tehát a teszt törzzsel ellentétes tipusúak voltak • Egy genetikai keresztezés jegyzőkönyve két NaCl-ra érzékeny két törzs keresztezése után a lenti táblázathoz hasonló • A markereket párosával összehasonlítva, sajátos mintázat alakul ki ott, ahol pl. mind a négy spóra különböző, vagy pedig két spórának ugyanaz a marker kombinációja; hogyan lehet ezt interpretálni? Tetrad Spore MAT leu ura his SUC NaCl 1 A a + + - - - 1 B alpha + - + - - 1 C a - - - + - 1 D alpha - + + + + 2 A a - - - - - 2 B a + + + + + 2 C alpha + - + - - 2 D alpha - + - + -

Élesztő genetika: meiózis • Először azt kell összegeznünk, hogy mi is történik a meiózisban: az élesztő tetrád analízis nem más, mint közvetlenül megfigyelni a meiózis eredményét • A diploid 2n, ennélfogva kromoszóma párjai vannak • A DNS replikáció mindkét kromoszómáról két azonos kromatidát eredményez • A kromoszómák párban vannak és közöttük történhet rekombináció • Majd az első meiotikus osztódás elválasztja a kromoszómákat egymástól • A második pedig a kromatidákat is, vagyis mindegyik spóra lényegében egy kromatidát jelent

LEU2 ura3 ura3 LEU2 leu2 URA3 URA3 leu2 Élesztő genetika: a keresztezés eredménye • Képzeljük el, hogy aLEU2és azURA3egymáshoz közel vannak ugyanazon a kromoszómán LEU2 ura3 LEU2 ura3 leu2 URA3 leu2 URA3 • Abban a valószínű esetben, ha a két marker között nem következett be cross-over, minden haploid spóra úgy fog kinézni, mint a szülői haploid törzsek • Csak két típusú spórát kapunk, (leu+ ura-) és (leu- ura+) spórákat • Ezért az ilyen tetrádot szülői ditipusnak nevezzük (parental ditype)PD

LEU2 ura3 ura3 LEU2 leu2 URA3 URA3 leu2 Élesztő genetika: cross over • Most azt képzeljük el, hogy a LEU2ésURA3egymáshoz közel vannak ugyanazon a kromoszómán és közöttük átkereszteződés, rekombináció következik be LEU2 ura3 LEU2 URA3 leu2 ura3 leu2 URA3 • Ebben az esetben most is kapunk szülői típusú spórákat, de olyanokat is, amelyek a két marker új kombinációit tartalmazzák • Négy különböző spóra típust kapunk • Ezért az ilyen tetrád a tetratípus (tetratype) T

LEU2 ura3 ura3 LEU2 leu2 URA3 URA3 leu2 Élesztő genetika: két cross over • ALEU2és azURA3 gének most is közel és ugyanazon a kromoszómán vannak, de két cross over lesz köztük, úgy hogy mind a négy DNS szál részt vesz a folyamatban LEU2 URA3 LEU2 URA3 leu2 ura3 leu2 ura3 • Ebben az esetben csak olyan spórákat kapunk, amelyek különböznek a szülői haploid típusoktól • Két különböző típusú spórát kapunk • Ezért az ilyen tetrád a nem szülői ditipus(non parental ditype)NPD • A közeli kapcsoltság miatt az a legvalószínűbb, hogy nem lesz cross over és a legkevésbé valószínű az, hogy két cross over is lesz, ezért a tetrádok megoszlása PD > T > NPD, és relatív számokat a térképtávolság kiszámítására használhatjuk • Hogy a mutációk új kombinációit előállíthassuk (mint pl. leu2 ura3)annál több tetrádot kell megvizsgálnunk, minél közelebb van a két gén egymáshoz és ezt a fizikai távolság (kb-ban) alapján becsülhetjük, ami nagyon jól korrelál a genetikai távolsággal ( cM, centi Morgan). Két közeli gén esetében (1 cM ~ 1% rekombináns spóra) minimum 25 tetrádot kell statisztikailag elemezni,

LEU2 ura3 ura3 LEU2 leu2 URA3 URA3 leu2 Keresztezés különböző kromoszómákon lévő markerekkel • Most azt képzeljük el, hogy a LEU2és azURA3különböző kromoszómákon vannak LEU2 ura3 LEU2 URA3 LEU2 ura3 LEU2 URA3 leu2 URA3 leu2 ura3 leu2 URA3 leu2 ura3 • A különböző kromoszómák az első meiotikus osztódás során véletlen szerűen kerülnek be az utód sejtekbe • Ezért a két tetrád típus egyforma gyakoriságú lesz, a szülői P és nem szülői ditípus NPD • Tehát a kapcsolt és a nem kapcsolt gének könnyen megkülönböztethetők tetrád analízissel, mert a nem kapcsolt gének esetében a PD=NPD, míg a kapcsolt géneknél PD>>NPD

LEU2 ura3 ura3 LEU2 leu2 URA3 URA3 leu2 Keresztezés különböző kromoszómákon lévő markerekkel • Legyen most aLEU2és azURA3különböző kromoszómán és crossing over következik be a centromer és a marker közötti részen LEU2 ura3 LEU2 URA3 leu2 ura3 leu2 URA3 • Most azURA3eltérő alléljei csak a második meiotikus osztódás után válnak szét • Az eredmény egy tetra típusú tetrád • A fenti helyzet azt is jelenti, hogy ha a markerek a centromertől távol vannak, akkor sok, ha pedig közel, akkor kevés T tetrád lesz • Mi lesz az eredménye a kettős cross overnek négy vagy három szál esetén? • A kettős cross over valószínűsége miatt a különböző tetrád típusok aránya nem kapcsolt gének esetében, amelyek nem kapcsoltak a centromerrel sem, a következő: 1:1:4 a PD:NPD:T-re • Ez azt is jelenti, hogy négy spórából egy lesz rekombináns, vagyis annak érdekében, hogy a gének (leu2 ura3) új kombinációját megkapjuk, elég egy tetrádot elemezni statisztikusan

Élesztő genetika: mutáns készítés • Az olyan mutációk, amelyek erősítik, vagy megszüntetik egy bizonyos fehérje funkcióját, nagyon hasznosak a sejt rendszerek vizsgálatánál • A mutációk fenotípusa, a mutáns tulajdonságai, sokat elárulhatnak egy gén, egy fehérje, vagy egy útvonal funkciójáról • Ez a megközelítés a szekvencia ismeretében és a teljes deléciós szet birtokában is igaz: a pontmutánsoknak más tulajdonságai lehetnek, mint a deléciós mutánsoknak • Véletlen, vagy célzott mutációk: • Random mutagenezissel a gének kapcsolatát keressük bizonyos funkcióval/szereppel; új géneket, vagy ismert gének új funkcióját azonosíthatjuk • Véletlen mutagenezisnél az egész genom a célpont • Véletlen mutagenezis lehetséges egy bizonyos fehérje esetében is, a génjét in vitro mutagenizáljuk; ebben az esetben a funkcionális doméneket azonosítjuk • Célzott mutageneziskor kiütünk, vagy megváltoztatunk egy bizonyos gént in vitro, vagy in vivo módszerekkel • Indukált, vagy spontán mutációk • A sejteket mutagénnel kezelve mutációkat indukálhatunk; ilyenkor persze több mutáció is kialakulhat sejtenként • Spontán mutáció „csak úgy” is bekövetkezhet, ilyenkor nagy valószínűséggel csak egy mutáció lesz a sejtben

Élesztő genetika: mutáns keresés • Szűrés (screening), vagy szelekció • Mutáns szűréskor az ember egyenként teszteli a klónokat, hogy megtalálja az érdekes mutánsokat • Ezért egyszerre sok sejtet széleszt és megpróbálja megtalálni azokat, amelyek replikázás után nem nőnek bizonyos táptalajokon, vagy más a színük, vagy az alakjuk • Screeninghez általában indukáljuk a mutációkat, hogy növeljük a gyakoriságukat • De: a screeninghez petri csészék százai kellenek és általában több mint 10 000 telepet kell vizsgálni • Egy új szelekciós rendszer kifejlesztése a genetikai analízis művészete • Ha szelektáljuk a mutánst, akkor olyan körülményeket teremtünk, hogy a mutáns fenotípusnak növekedési előnye legyen • Más szavakkal kifejezve, az a feladat, hogy olyan körülményeket állítsunk elő és/vagy olyan törzseket, hogy a mutáns tudjon szaporodni, a vad típus pedig ne • Az elegáns szelekciós rendszer lehetővé teszi, hogy spontán mutánsokat izoláljunk, mert 108sejtet könnyedén széleszthetünk egy lemezre • A szelekciós rendszerek gyakran inhibítor-rezisztencián alapulnak YPD YPD + 0.4M NaCl Wild type hog1D sko1D aca1D aca2D hog1D sko1D hog1D aca1D aca2D hog1D sko1D aca1D aca2D YPD + 0.4M NaCl YPD Wild type aca2D hog1D hog1D aca2D

Élesztő genetika: mutánsok jellemzése • Ha már izoláltuk a mutánsokat, akkor azokat jellemezni kell és azonosítani kell az érintett géneket; a következők szerint • Részletes fenotípus analízis, vagyis más, nem csak a szűrés/szelekció során használt fenotípusok vizsgálata • Ki kell mutatni, hogy a mutáns domináns-e, vagy recesszív • A mutánsokat komplementációs csoportokba kell rendezni. Egy komplementációs csoport általában egy gént jelent. • A gén klónozása komplementációval.

MUT1 MUT1 mut1 mut1 Domináns és recesszív fenotípus • A domináns, vagy recesszív karakter felderíthető, ha a mutánst vad típussal keresztezzük, hogy diploid sejtet képezzenek • Az ilyen diploidok heterozigóták, mert az egyik kromoszómájukon a vad allél, a másikon pedig az érintett mutáns allél van • A mutáció domináns, ha a mutáns fenotípus nyilvánul meg a heterozigóta sejtekben. A diploid fenotípusa ugyanolyan, mint a haploid mutánsé • Egy mutáció recesszív, ha a vad típusú fenotípus nyilvánul meg a heterozigóta diploidban. A diploid fenotípusa olyan, mint a vad típus. Recesszív: vad fenotípus Domináns: mutáns fenotípus

MUT1 MUT1 mut1 mut1 Domináns és recesszív mutáció • Domináns karakter számos ok miatt lehet, amelyek segíthetnek a géntermék szerepének felderítésében: • A mutáció funkció nyerést okoz (gain of function), azaz a szabályozó fehérje akkor is működik, ha nincs a szokásos stimuláció • A géntermék homo-oligomerként működik és a nem-funkcionális monomer az egész komplex működését elrontja • Az egyetlen vad típusú allél kevés a vad típusú fenotípushoz, azaz nincs elég működőképes géntermék (nagyon ritka) • A recesszív karaktert gyakran a géntermék funkció vesztése (loss of function) okozza. • Ez azt is jelenti, hogy a recesszív mutáció sokkal gyakoribb, mert könnyebb valamit elrontani, mint előállítani • Mutánsunk további genetikai analízise a domináns/recesszív jellegtől függ, ezért is ez az első lépés • Aztán még, hasznos, ha a diploid tetrád analízisét elvégezzük, hogy kiderítsük, hogy a mutáns fenotípust egyetlen mutáció okozta-e; a fenotípusok 2:2 arányban szegregálnak legalább tíz megvizsgált tetrádban; ez különösen fontos, ha indukáltuk a mutációt. Recesszív: vad fenotípus Domináns: mutáns fenotípus

mut1 MUT1 mut2 mut2 mut1 MUT1 mut1 mut1 MUT2 MUT2 mut1 mut1 Komplementációs csoportok MUT1 –nek nincs működő génterméke • Bizonyos fenotípusú mutánsok szelekciója/screeningje és a domináns/recesszív jelleg meghatározása után tudni szeretnénk, hogy az izolált mutánsok azonos, vagy különböző génekben érintettek-e • Recesszív mutációkra ezt komplementációs analízissel derítjük ki • Ehhez eltérő párosodási típusú mutánsok kellenek, hogy diploidokat állíthassunk elő (ezt úgy érhetjük el, hogy a mutánsokat már eleve más párosodási csoportba tarozó és komplementáló markerű törzsből készítjük) • A mutánsokkal aztán minden lehetséges kombinációban diploidokat képeztetünk; ami azt jelenti, hogy ha pl. 12 a-típusú és 9 alfa-típusú mutánsunk van, akkor 9x12=108 kersztezés lehetséges. • Ha két mutánsunknak recesszív a mutációja egy és ugyanazon génben, akkor a diploid szintén mutáns fenotípusú lesz • Ha a két haploid recesszív mutációja két különböző, de ugyanolyan fenotípust okozó génben van, akkor a mutánsok komplementálják egymást és a diploid vad fenotípusú lesz. • Ezért, ha amut1és amut2két különböző komplementációs csoportot reprezentál, nagy valószínűséggel különböző géneket jelentenek MUT1ésMUT2-nek működő génterméke van

Intragénes komplementáció • Az intragénes komplementáció ugyan ritka, de előfordul • Két mutáns allél, mint pl. a mut1-1és amut1-2, a haploid sejtekben egyértelmű mutáns fenotípust okoz és recesszívek • A heterozigótamut1-1/mut1-2viszont (részben) vad típusú • Az a magyarázat, hogy a két mutáns fehérjetermék, a Mut1-1p és a Mut1-2p olyan heteromert képeznek, amelyik egy kicsit működik • Ezt néhány metabolizmus enzim esetében tudták jól kimutani (ILV1, egy feedback szabályozott enzim az aminosav bioszintézisben) • Az intragénes komplementáció jelensége azt mutatja, hogy a géntermék oligomerként funkcionál • Az ”ellentéte”, a nem-alléles nem komplementáció is előfordulhat természetesen: két recesszív mutáció két különböző génben nem komplementálnak. Ez akkor fordulhat elő, ha a két géntermék ugyanabban a folyamatban, vagy komplexben vesz résztés két működő allél kevés a teljes működőképességhez MUT1 –nek nincs működő génterméke mut1-1 mut1-1 mut1-2 mut1-2 De aMut1-1p és Mut1-2p heteromer lehet működőképes

Klónozás élesztőben • Az élesztő molekuláris genetika 1978-ban kezdődött, amikor a S. cerevisiae–t sikeresen transzformálták idegen DNS-sel • Számtalan transzformációs módszer van, de a legjobb is legalább három nagyságrenddel rosszabb hatékonyságú, mint az E. colitranszformáció • Az élesztőben replikálódó plazmidok kópiaszáma egy és ötven között van sejtenként • Az élesztő többféle plazmidot is elvisel egyszerre. Ez komplikálhatja a génkönyvtárakból való klónozást. Ez ugyanakkor nagyon hasznos, ha két plazmiddal egyszerre akarjuk transzformálni az élesztőt, pl. a plazmid shuffling módszer esetében • A plazmid tisztítás élesztőből és a klónozás élesztőben nem hatékony • Ezért az E. coli-t használjuk plazmid termelésre: • A plazmidokat in vitro készítjük, E. coli-t transzformálunk, ellenőrizzük a konstrukciót a baktériumban termeltetjük a plazmidot és végül transzformáljuk az élesztőt • Ezért úgynevezett élesztő- E. coli ingázó vektorokkal (shuttle vector) dolgozunk • Ugyanakkor az élesztő homológ rekombináiós rendszere nagyon hatékony és megbízható, amit kihasználhatunk a klónozásnál

Élesztő-E. coliingázó vektorok • Integrálódó plazmidok (YIp) felépítése • E. coli vektor alap, mint a pBR322, pUC19, pBLUESCRIPT • Élesztő szelekciós marker (URA3, HIS3, TRP1, LEU2) • Nincs élesztő replikációs origó • Ezért csak a genomba való beépülés után tarthatók fenn R I (2) Eco I (28) Cla LI (5217) d III (33) Apa Hin Amp-rezisztencia H I (379) Bam I (4795) Pst Tet-rezisztencia YIp5 5541bp LI (3971) Apa I (1644) Pst PMB1 I (1867) Nco LI (3473) URA3 Apa I (2541) Ava I (2541) Xma YIp5: pBR322 +URA3 gén I (2543) Sma

Plazmid beépülés az élesztő genomba • A beépülés homológ rekombinációval történik, ez azt jelenti, hogy az olyan plazmidok, mint pl. az Ylp5 az URA3 lokuszba integrálódik • A bépülés eredményeként a célszekvencia megkettőződik • A duplikálódott DNS határolja a vektort • Ha a plazmidban több mint egy élesztő gén van, akkor az egyik gént enzimmel hasítva célzottan abba a génbe irányíthatjuk a plazmidot: a lineáris DNS rekombinációs hajlama igen nagy • Az integrálódott plazmid nagyon stabilan a helyén marad, bár a duplikálódott szekvenciáknál néha rekombinációval ki is hurkolódhat plazmid URA3 X genom ura3 X genom ura3 URA3

Élesztő-E. coliingázó vektorok • A replikatív episzómás plazmidok (YEp) felépítése • E. coli vektor alap(pBR322, pUC19, pBLUESCRIPT) • Élesztő szelekciós bélyeg(URA3, HIS3, TRP1, LEU2) • Az élesztő 2μ-os plazmid replikációs origó • Viszonylag stabilan 20-50 kópia sejtenként • Kópiaszámuk növelhető 200/sejt-re a részlegesen defektív LEU2 gén felhasználásával LI (7445) R I (2) Apa Eco Amp-rezisztencia d III (106) Hin I (7023) Pst 2μ ORI I (1391) Ava LI (6199) Apa PMB1 YEp24 I (2001) Pst 7769bp LI (5701) R I (2242) Apa Eco I (2268) Cla d III (2273) Hin I (2482) Pst I (4835) I (2705) Ava Nco URA3 I (3379) Xma Tet-rezisztencia I (3379) Ava I (3381) Sma d III (3439) Hin H I (3785) Bam YEp24: pBR322 +URA3 gén, + 2μ origó

R I (2) Eco LI (7626) I (28) Apa Cla Amp-resistance d III (33) Hin I (7204) H I (379) Pst Bam Tet-resistance POLY LI (6380) I (1644) Apa Pst PMB1 I (1867) Nco YCp50 LI (5882) Apa URA3 7950bp LI (5457) I (2541) Apa Xma I (5451) I (2541) Pst Ava ARS1 I (2543) Sma POLY I (4703) Ava CEN4 Élesztő-E. coliingázó vektorok • A replikatív centromerás plazmidok (YCp) felépítése • E. coli vektor alap(pBR322, pUC19, pBLUESCRIPT) • Élesztő szelekciós bélyeg(URA3, HIS3, TRP1, LEU2) • És még egy élesztő kromoszóma replikációs origó, ARS (autonomously replicating sequence) • Valamint egy élesztő kromoszóma centromeron (CEN) • Ezért stabilak, egy kópia sejtenként YCp50: pBR322 +URA3 gén, + CEN4, + ARS1

Élesztő-E. coliingázó vektorok • YIp típusú csak integrációra • YCp kis kópiaszám, expresszióra • YEp túltermeltetésre • Plazmid sorozatok • E. coliklónozó vektor alap • Egy, vagy több élesztő szelekciós bélyeg • Alap típusok YIp, YCp ésYEp

Komplementációs klónozás • Amikor már izoláltuk és komplementációs csoportokba rendeztük a mutánsokat, a génről még mindig nem sokat tudunk ( és ez gyakran még most, a teljes genom szekvencia ismeretében is így van!) • A génazonosításához klónozzuk egy génkönyvtárból a mutáció komplementációjával • A génkönyvtár egy olyan nagy plazmid populáció, ahol a plazmidokban az élesztő genom DNS-ének különböző fragmentumai vannak, amelyek összességében a teljes élesztő genomot reprezentálják • A génkönyvtárat úgy készítjük, hogy a teljes élesztő DNS-t pl. a gyakori hasító hellyel rendelkező Sau3A-val (GATC) csak részlegesen emésztjük; így egymással átfedő DNS fragmentumokat kapunk, ami biztosítja, hogy minden génből legyen működőképes génünk; a Sau3A fragmentumokat a kompatibilis BamHI-el (GGATCC) emésztett vektorba ligáljuk; minden élesztő könyvtárat hasonló elven készítettek • Ha klónozott DNS fragmentumok átlagos mérete 5-9 kbp, a genom egyszeres reprezentációja 2 000 plazmidban van és 10 000 plazmidban több mint 90%-os valószínűséggel az összes gén működőképesen található meg • A teljes könyvtárral transzformáljuk a mutánsunkat • A transzformált sejteket a vad fenotípus helyreállítására szűrjük, vagy szelektáljuk • A pozitív klónokból plazmidot izolálunk és ezekkel E. coli-t transzformálunk és tovább vizsgáljuk; a szekvencia igazolja a klónunkat • Klónunkkal újra transzformáljuk a mutáns élesztőt és ezzel igazoljuk, hogy a plazmid valóban tartalmazza a komplementáló gént; ez azért szükséges, mert az élesztő többféle plazmidot is képes felvenni

Komplementációs klónozás • A komplementációs klónozás nagyon egyszerűnek és üdvözítőnek tűnik, de azért jó néhány gond lehet vele • Először is, csak recesszív mutánsokkal lesz sikeres • Domináns mutáns gének klónozásához minden egyes mutánsunkból génkönyvtárat kell készíteni és ezekkel transzformáljuk a vad típusú törzset; a mutáns fenotípusra szűrjük/szelektáljuk a transzformánsokat • Továbbá, egy mutáció komplementációja nem biztos, hogy azt jelenti, hogy valóban a klónozott génünk az ami komplementálja a mutánsunk hibáját – ez lehet egy sokkópiás szupresszor is • Ez előfordulhat a centromerás vektorokkal is, mert a szelekciós nyomás ezeknek a plazmidoknak is föltornázhatja a kópiaszámát • A sokkópiás szupresszor egy olyan gén, amelyik felülkerekedik a mutáns hibáján, ha nagy mértékben megnyilvánul; ez gyakori jelenség • Ez valóban olyan gyakori jelenség, hogy bizonyos mutánsokkal elkezdve új géneket klónozhatunk (még erre visszatérünk) • Azt kimutatni, hogy a klónozott génünk az egyetlen, amelyik hibás a mutánsunkban, úgy lehet, hogy a klónozott génünket templátként használva, homológ rekombinációval deléciós mutánsokat készítünk • Ha az eredeti és a deléciós mutáns is ugyanazt a fenotípus mutatja, akkor ez jó bizonyíték arra, hogy a két gén azonos • Végső bizonyítékot a két mutáns keresztezéséből kaphatunk; ha a diploid is mutáns fenotípusú és a diploidból izolált valamennyi spóra is, ez már bizonyítja a két gén azonosságát • A gének deléciója homológ rekombinációval az egyik leghatékonyabb technika az élesztő esetében és ez is az egyik ok, amiért az élesztő ilyen népszerű

mut1D MUT1 mut2 mut2 mut1D MUT1 mut1 MUT2 MUT2 mut1 Komplementációs klónozás • Ha az eredeti mutáns és a deléciós mutánsnak ugyanaz a fenotípusa, akkor ez jó bizonyíték arra, hogy a két gén azonos • A végső bizonyítékot a két mutáns keresztezése szolgáltatja; ha a diploid mutáns fenotípusú (vagyis nincs komplementáció az eredeti és a deléciós mutáns között) biztosak lehetünk abban, hogy a klónozott génünk az amelyik eredetileg elromlott • A 100%-os bizonyosság kedvéért spóráztatjuk a diploidot és néhányszor tíz tetrádot megvizsgálunk: minden spóra mutáns fenotípusú kell legyen • A gének deléciója homológ rekombinációval az egyik leghatékonyabb technika az élesztő esetében és ez is az egyik ok, amiért az élesztő ilyen népszerű MUT1 génnek nincs funkcionális génterméke MUT1és MUT2gének funkcionális géntermék mut1D mut1D

YFG1 Kedvenc génje egy plazmidban Kedvenc génje a plazmidban, az ORF a mrker génre cserélve URA3 URA3 X X Rekombináció az élesztőben Egy élesztő gén deléciója • A klónozott gén felhasználásával a nyitott leolvasási keretetből in vitro kivágunk egy darabot és kicseréljük egy marker génre • A marker génünket így az eredeti génünkből származó szekvenciák határolják • Ezzel a DNS-sel transzformáljuk az élesztőt, ahol homológ rekombinációval a kromoszómán lévő gén erre cserélődik ki; a transzformánsokat a marker génre szelektáljuk • Ezt követően Southern blot-tal (DNS-DNS hibridizálással), vagy PCR-rel és az élesztő törzs fenotípusának vizsgálatával igazoljuk a deléciót • A módszer igen megbízható és 1µg DNS-sel biztosan kapunk néhány transzformánst. Ugyanez növény-, vagy állat-sejtekkel eltarthat néhány évig. in vitro Kedvenc génje eltávolítva a genomból in vivo URA3

Egy élesztő gén deléciója • Több lehetőségünk is van a transzformáló DNS elkészítésére, mármint hogy a markert a YFG1génből származó szekvenciák fogják közre • Elkészíthető restrikciós endonukleázokkal (RE) és ligálással • Ekészíthető: PCR/restrikció/ligálás; az egész plazmid amplifikálható PCR-rel az ORF kivételével; a PCR primerekkel generálhatjuk a marker gén klónozására alkalmas RE hasító helyet • Elkészíthető csak PCR-rel, minden klónozási lépés nélkül; két külön PCR reakcióban amplifikáljuk a YFG1 határoló szakaszait és a második körben ezeket használjuk primerként a marker gén sokszorozáshoz, a primereket természetesen ennek megfelelően kell megtervezni (lásd lent) • Elkészíthető hosszú PCR primerekkel, melyekkel csak a markert amplifikáljuk, a rekombináció pedig a primer szekvenciáknál következik be; 30 bp már elegendő a rekombinációhoz; ilyen esetekben heterológ marker ajánlott, hogy a beépülés a megfelelő helyre történjen • A két utóbbi módszerhez nem szükséges a klónozott gén!! Egy gén deléciója így csak néhány nap. Először PCR-rel amplifikáljuk a kedvenc génünk határoló szakaszait YFG1 Majd a markert amplifikáljuk URA3 URA3 A kész PCR termék kész a transzformációra

lacZ URA3 YFG1 Diploid sejt Okos gén deléció • Az alkalmazott marker kazettától függően, nagyon okosan készíthetjük el a deléciós/megszakításos (gene disruption) mutánsunkat, a későbbi alkalmazásokhoz • Például, ha a marker kazettánk tartalmazza a lacZ riporter gént, akkor pontos fúziót tudunk előidézni azért, hogy a riporter gént a YFG1 promótere szabályozza • Ha ilyen konstrukcióval készítünk deléciót egy diploidban, akkor vizsgálhatjuk a gén megnyilvánulását a diploidban a β-galaktozidáz enzim aktivitásának mérésével és spóráztatás után a mutáns fenotípust a haploid utódokban. • Hasonló módon meg is jelölhetünk egy gént (gene tagging). Ha például a kazettát frame-ben építjük be az ORF valamelyik végéhez, akkor fúziós fehérjéket kapunk, LacZ, GFP, vagy immuno-tag jelöléssel a fehérjénk kimutatásához, vagy tisztításához

Hasonló módon meg is jelölhetünk egy gént (gene tagging). Ha például a kazettát frame-ben építjük be az ORF valamelyik végéhez, akkor fúziós fehérjéket kapunk, LaZ, GFP, vagy immuno-tag jelöléssel a fehérjénk kimutatásához, vagy tisztításához Már elkészítették azokat az élesztő törzseket, amelyekben a géneket GFP, vagy TAP-tag-el jelölték YFG1 GFP URA3 Okos gén deléció

Okos gén deléció • Van néhány lehetőség arra, hogy úgy készítsünk deléciós törzseket, hogy ne maradjon utána nyom, azaz marker gén nélkül • Ez akkor nagyon fontos, ha a markert újra használni akarjuk, azért, hogy sok deléciót készíthessünk egy és ugyanazon törzsben ( vannak olyan törzsek, amelyekben több mint húsz deléció van) • Különösen fontos ez az ipari törzsekben; amikor is számít, hogy fölösleges idegen DNS ne maradjon vissza a folyamat végén • Az összes ilyen módszer is a homológ rekombinációt használja ki másodjára, hogy az integrálódott DNS kihurkolódjon • Erre jók példáula loxP-kanR-loxP kazetták; a két loxP kazetta közötti rekombinációt a Cre-rekombináz (külön plazmidon transzformálva) stimulálja; rekombináció után egyetlen loxP hely marad vissza (cre-lox a P1fágból)

Okos gén deléció • Nagyon hasznos az URA3 markerrel dolgozni, mert ennek jelenlétében lehet erre is, meg ellene is szelektálni • URA3–ra természetesen uracil mentes táptalajon szelektálunk • AzURA3ellen az 5-fluoro-orotic acid (5-FOA) droggal szelektálhatunk, ami az URA3 sejtekre toxikus • Egy példa: URA3 plazmid YFG1 genom YFG1 URA3 Csak az YFG1 határoló szekvenciáit tartalmazó plazmid beépüéseduplikációt okoz; a kék szekvenciák közötti rekombináióval a teljes plazmid és még az YFG1 gént kódoló régió is kihurkolódik

Hogyan dolgozzunk esszenciális génekkel? • Tárgyaltuk a kémiai és a célzott mutagenezist; kézenfekvő kérdés, hogy hogyan is izoláljunk és dolgozzunk olyan mutánsokkal, amelyekben a mutáció a sejt számára nélkülözhetetlen termékeket kódoló génekben van (és ilyen kb. a gének 1/3-a)? Az a mutáció ugyanis, amelyik tönkreteszi a géntermék fehérjét, megöli a sejtet és döglött sejttel nehéz dolgozni. • Kémiai mutagenezisnél kondicionális mutánsokat keresünk; általában hőérzékeny (ts) mutánsokat, ahol a géntermék alacsony hőmérsékleten működőképes, magas hőmérsékleten pedig nem; nagyos sok esszenciális sejtfunkciót ts mutánsokkal azonosítottak • Deléciós kísérletekben úgy döntjük el azt, hogy egy gén nélkülözhetetlen, hogy a deléciót diploid törzsben készítjük; és ha spóráztatás után csak két spóra lesz életképes és egyetlen élő spóra sem hordozza a markert, akkor elismerhetjük, hogy a gén esszenciális • Dolgozhatunk nélkülözhetetlen gének mutánsaival is. Elsősorban akkor, ha a mutánst olyan plazmiddal transzformáljuk, amelyik a kérdéses gént kondicionálisan expresszálja • Például, ha a plazmidban az esszenciális gént a GAL1 gén promótere működteti; ez a promóter bekapcsolható galaktózzal, glükózzal pedig kikapcsolható; ha glükózra váltunk, akkor legalábbis egy kis ideig vizsgálhatjuk a sejtek tulajdonságait …. és vizsgálhatjuk pusztulás közben (yfg1D pGAL1-YFG1) • Az in vitro készített pontmutánsok működését vizsgálandó, használhatjuk a plazmid shuffling technikát. Ilyenkor a mutánst először a vad típusú gént tartalmazó plazmiddal transzformáljuk, majd a mutáns génnel. A vad gént hordozó plazmidon kell legyen az URA3 mint szelektálható marker, amit aztán 5-FOA tartalmú táptalajra szélesztve a transzformánsokat arra kényszerítjük, hogy tűnjön el a sejtből. Ha a mutáns nő 5-FOA jelenlétében, akkor a mutáns allél működőképes (yfg1D pURA3::YFG1 pLEU2::yfg1-1).

ÉLESZTŐ GENETIKA ÉS MOLEKULÁRIS BIOLÓGIA