Explantátové kultury rostlin

1. Explantátové kultury rostlin • 1. Charakteristika explantátových kultur • explantátové kultury rostlin vznikají aseptickou kultivací izolovaných částí rostlin za umělých podmínek • oddělení určité části ze sterilně napěstované nebo povrchově sterilizované rostliny a umístění této části rostliny do sterilního prostředí, kde se kultivuje • v rostlinném organismu jsou všechny buňky totipotentní • pro odvození explantátové kultury je tedy vhodné jakékoliv pletivo obsahující buňky s funkčním jádrem • rostlinné explantátové kultury zahrnují izolaci buněk, pletiv a orgánů a jejich kultivaci ve sterilních podmínkách

2. růst a vývoj explantátových kultur umožňují kultivační podmínky: • kultivační médium - zdroj energie, výživy a regulačních látek • světelný režim - intenzita a kvalita světla a fotoperioda • teplota • vlhkost • za určitých podmínek mohou být z explantátových kultur dopěstovány nové rostliny (cíl většiny manipulací in vitro) • tento proces je uskutečněn podle následujícího cyklu: rostlina – explantát – kultura in vitro - organogeneze nebo embryogeneze – intaktní rostlina • v explántátové kultuře lze vyvolat růst a další vývoj základů orgánů, které již byly založeny na donorové rostlině • podmínky kultivace mohou stimulovat a urychlovat průběh morfogenního procesu; dochází k dokončení vývinu izolovaného embrya a k jeho klíčení, nebo vytváření postranních větví z axilárních pupenů a k tvorbě nových axilárních pupenů na těchto větvích

3. podle charakteru nově vzniklých struktur rozlišujeme organogenezi, somatickou embryogenezi (popř. somatickou polyembryogenezi) a pylovou embryogenezi či androgenezi • úspěšnost kultivace explantátových kultur je ovlivněna četnými faktory (Murashige, 1974; George, Sherrington, 1984); mezi nejdůležitější faktory patří: • orgán, ze kterého byl izolován explantát • fyziologické a ontogenetické stádium rostliny • období odběru explantátu • velikost explantátu • zdravotní stav donorové rostliny • genotyp • orientace explantátu • inokulační hustota

4. 2. Laboratoř explantátových kultur • 2.1. Zařízení laboratoře explantátových kultur • prostor pro mytí skla a laboratorních pomůcek • dřezy k mytí skla • zařízení k sušení skla • destilační přístroj • prostor pro přípravu a sterilizaci médií • chemický stůl • analytické váhy • vařič (popř. vodní lázeň) • pH metr • autokláv pro sterilizaci při 121 ºC • lednice, mraznička • skladovací prostor na chemikálie a sklo • prostor pro aseptickou manipulaci se sterilní kulturou • aseptický box (flow box) • germicidní zářivka • preparační mikroskop • stolní třepačka • nástroje pro odběr preparátů • kahan

5. kultivační místnost s řízenými kultivačními podmínkami (teplo, světlo, vlhkost) • klimatizační jednotka • třepačky • 2.2. Základní úkony prováděné v laboratoři • mytí skla • sterilizace • sterilizace kultivační místnosti • sterilizace nástrojů a skla • autoklávování • sterilizace živných roztoků • sterilizace rostlinného materiálu • práce ve flow boxu • před prací v boxu je nutné jeho vnitřní strany vytřít dezinfekčním roztokem (70% ethanol) • box je nutné pustit 15 minut před prací (ustálení proudu vzduchu) • veškeré předměty používané v boxu musí být sterilní • je vhodné pracovat s rukavicemi

6. 3. Kultivační média pro explantátové kultury • složení kultivačního média je jedním z nejdůležitějších faktorů ovlivňujících růst a morfogenezi v explantátových kulturách rostlin • média používaná pro kultivaci buněk, pletiv a orgánů obsahují obvykle následující složky: • makroelementy • mikroelementy • sacharidy • vitamíny • aminokyseliny • zpevňující látku • růstové regulátory • mezi nejčastěji používaná média patří • MS (Murashige, Shoog, 1962) • White (White, 1963) • B5 (Gamborg et al., 1968) • SH (Shenk, Hildebrant, 1968) • Lloyd-McCown (Lloyd, McCown, 1981)

7. makroelementy • dusík, fosfor, draslík, vápník, hořčík, síra koncentrace jednotlivých prvků je závislá na rostlinném druhu • mikroelementy • nezbytné - železo, mangan, zinek, bór, měď a molybden. • nemusí být nezbytné - kobalt, jód, sodík a chlór • sacharidy • zdroj uhlíku a energie - sacharóza heterotrofní výživy explantátů, schopnost autotrofní výživy je velmi omezena • vitamíny • nezbytné pro rostliny • katalyzátory metabolických procesů • nezbytné k růstu a vývoji rostlin • limitující faktor růstu explantátových kultur • nejčastěji používané vitamíny - thiamin, kyselina nikotinová, pyridoxin a myo-inositol • ostatní - biotin, kyselina listová, kyselina askorbová, kyselina pantotenová, riboflavin

8. aminokyseliny • zdroj dusíku v organické formě • využití přímo k syntéze proteinů • dodávány ve směsi aminokyselin (např. kasein hydrolyzát), často se používá také L-glutamin, L-asparagin a glycin. • látky pro zpevnění média • nejčastěji používanou látkou pro zpevnění média je agar • další - syntetické látky Phytagel a gerlit. • růstové regulátory • rostlinné hormony jsou přirozené i syntetické regulátory růstu • přirozené regulátory jsou syntetizovány rostlinou samotnou (fytohormony) • rostlinný hormon je organická sloučenina syntetizovaná v jedné části rostliny a translokovaná do části jiné, kde vyvolává fyziologickou reakci • přirozené i syntetické růstové regulátory rozlišujeme na regulátory povahy stimulační (stimulátory) a povahy inhibiční (inhibitory). • růstové látky (stimulátory)lze rozdělit do tří základních skupin: auxiny, cytokininy a gibereliny • zábranné látky (inhibitory) - kyselina abscisová • etylen • látky s růstově regulačním působením - brassinosteroidy, kyselina jasmonová, polyaminy, oligosacharidy, turgoriny, benzolinon a další

9. auxiny • stimulují v kultivačním médiu růst kalusu a buněk • stimulují tvorbu adventivních kořenů na segmentech stonků i u explantátů • významný prostředek pro vyvolání somatické embryogeneze • spolu s cytokininy základní složkou médií pro explantátové kultury • nejčastěji používanými auxiny jsou: kyselina indolyl-3-octová (IAA) - přírozený kyselina indolyl-3-máselná (IBA) - syntetický kyselina 2,4-dichlorfenoxyoctová (2,4-D) - syntetický kyselina α-naftyloctová (NAA) - syntetický • cytokininy • stimulují buněčné dělení a tvorbu axilárních prýtů • iniciace diferenciace pupenů a kořenů v explantátových kulturách (v interakci s auxinem) • pro růst explantátové kultury, tvorbu kořenů a prýtů (organogenezi) je důležitý vzájemný poměr stimulátorů • při vysokém poměru auxinu k cytokininu je stimulována iniciace tvorby kořenů, embryogeneze a iniciace tvorby kalusu • je-li tento poměr nízký, dochází k indukci tvorby adventivních a axilárních prýtů

10. cytokininy jsou využívány v rostlinných biotechnologiích jako složka kultivačních médií při odvozování a udržování rostlinných explantátových kultur a dále při regeneraci rostlin in vitro • uplatňují se při kultivaci vyvíjejících se somatických embryí a hrají klíčovou úlohu při vytváření apikálního meristému u somatických embryí • cytokininy používané v kultivačních médiích: benzylaminopurin (BAP) - syntetický 6-dimetylaminopurin (IPA) -přirozený furfurylaminopurin (kinetin) - syntetické zeatin - přirozený • gibereliny • stimulují dlouživý růst (pouze nadzemních částí rostlin) • stimulují buněčné dělení (dělení je stimulováno v přechodu z fáze G1 do S a fáze S je obvykle zkrácena) • pro většinu explantátových kultur nejsou tyto látky nezbytné • gibereliny používané v kultivačních médiích: GA3, GA7 • kyselina abscisová (ABA) • způsobuje inhibici růstu, navozuje dormanci pupenů a semen • exogenně aplikovaná ABA působí inhibičně na klíčení semen • její hladina v semenech sesnižuje při výstupu z dormance účinkem nízkých teplot, resp. světla • ABA je důležitá pro maturaci somatických embryí

11. etylen • jediný dosud známý plynný hormon • stimuluje dozrávání některých plodů • inhibuje dlouživý růst a stimuluje růst radiální • inhibuje růst kořenů • látky s růstově regulačním působením • nejsou řazeny mezi fytohormony z důvodu jejich výskytu ve vyšších koncentracích než je tomu obvyklé pro hormonální látky • brassinosteroidy - významně zvyšují rezistenci rostlin ke stresům • polyaminy (PA) - způsobují v systémech in vitro růstovou stimulaci - dochází k intenzivnímu buněčnému dělení - PA hrají významnou úlohu v obraně rostlin proti stresům • glukosaminové oligosacharidy - účastní se odezvy rostlin na napadení patogeny - aktivují syntézu fenylalaninamoniaklyázy (PAL), klíčového enzymu syntézy fenolických obranných látek, fytoalexinů - aktivují syntézu stresového hormonu etylenu

12. organické extrakty • protein hydrolyzát • kokosové mléko • sladový extrakt • banánový extrakt • pomerančová a rajčatová šťáva jejich použití se však příliš nedoporučuje pro jejich nedefinovatelné složení

13. 4. Metody explantátových kultur • mikropropagace – tradiční způsob vegetativního množení rostlin • výhody mikropropagace – kultura se odvozuje z velmi malých částí rostlin (explantátů) – možnost produkce velkého množství rostlin – rozmnožování v podmínkách in vitro – nedochází ke kontaminaci – rychlost množení je mnohem vyšší než u tradičních metod – klonování in vitro je možné po celý rok – mezi pasážemi nevyžadují prakticky žádnou péči • nevýhody mikropropagace – relativně drahé laboratorní vybavení – pracná metoda, drahý provoz – existuje nebezpečí vzniku geneticky aberantních rostlin

14. Teoreticky možné metody mikropropagace • množení rostlin indukcí tvorby prýtů z axilárních pupenů nejrozšířenější metoda kultivace in vitro založena na simulaci růstu axilárních pupenů při potlačení apikální dominance • metoda kultivace vzrostlých vrcholů • metoda kultivace jednonodálních stonkových segmentů • tvorba adventivních prýtů nebo adventivních somatických embryí přímou morfogenezí vznikají přímo na částech orgánu nebo pletiv • přímá tvorba adventivních pupenů • přímá embryogeneze nepřímou morfogenezí - nepřímá organogeneze z neorganizovaného kalusového pletiva vznikají kořeny, stonky, popř. celé rostliny - nepřímá somatická embryogeneze

15. množení z axilárních pupenů množení tvorbou adventivních prýtů nebo embryí Metody mikropropagace rostlin (George and Sherrington, 1984)

16. Embryogeneze in vitro • embryogeneze je proces, při kterém z jedné buňky, nejčastěji zygoty, vzniká postupnými strukturálními změnami zárodek (embryo) • dělením zygoty se vyvíjí zralý zárodek, který je uložen v semeni • zárodky mohou vzniknout i z jiných buněk rostliny zárodky haploidní - z haploidních buněk gametofytu zárodky diploidní - z diploidní buňky nucellu - z diploidních somatických buněk • rozlišujeme následující případy embryogeneze: embryogeneze zygotická – základem embrya je zygota, embryogeneze gametofytická (prezygotická) – základem embrya jsou haploidní gametofytické buňky, embryogeneze somatická (postzygotická) – základem embrya jsou buňky somatické, somatická polyembryogeneze – základem embrya jsou rovněž buňky somatické, tento případ embryogeneze je charakteristický pro jehličnany.

17. Somatická embryogeneze - základem embrya u somatické embryogeneze jsou buňky somatické - somatická embrya během svého vývoje procházejí stejnými vývojovými fázemi jakoembrya zygotická - iniciaci, vývoj a diferenciaci somatických embryí ovlivňující následující faktory: • původ explantátu, • minerální složení kultivačního média, • růstové regulátory, • cukry, • fyzikální podmínky kultivace, • kultivační nádoby a konzistence kultivačního média (pevné, tekuté), • plynná fáze uvnitř kultivační nádoby, • hustota buněčné suspenze. 

18. Fáze mikropropagace vývoj rostlin v podmínkách in vitro je možné rozdělit do čtyř fází • odvození sterilní (aseptické) kultury – primokultury - odebrání vhodného explantátu, jeho sterilizace a kultivace na živném médiu • fáze proliferace explantátové kultury - dosažení vysokého koeficientu množení a získání co největšího počtu nových explantátů cestou somatické embryogeneze, popř. tvorbou adventivních pupenů - proliferační fáze může být opakována nebo může následovat třetí fáze • zakořeňování in vitro - nevýhodou kořenů vytvořených v podmínkách in vitro je častá absence kořenového vlášení a také jejich křehkost, která způsobuje, že se při přenosu rostlin do půdy lámou - u většiny druhů indukce tvorby kořenů vyžaduje větší přítomnost auxinu • zakořeňování in vivoa aklimatizace - převod rostlin z kultury in vitro do podmínek in vivo - Zakořeňování in vivo v nesterilních podmínkách na substrátech (např. perlit, vermikulit, směsi obsahující písek, rašelinu a čedičovou vatu atd.)

19. 5. Využití explantátových kultur • ozdravování rostlin a produkce bezvirózního materiálu • masová produkce geneticky identického materiálu cestou mikropropagace • rychlé namnožení nově vyšlechtěných odrůd • uchování genobanky jednotlivých druhů, kultivarů • produkce haploidních rostlin jako výchozího materiálu pro šlechtitelské programy - využití v programech pracující s rekombinantní DNA (genové inženýrství) - somatická hybrydizace , somaklonální variabilita

20. Úvod do praktické části • schema odvození polyembryonální kultury smrku ztepilého • příprava kultivačního média LP/2 • práce s kulturami in vitro, růst a pasážování kultur • odebrání vzorku a jeho příprava pro analýzu • stanovení životnosti embryogenní kultury smrku a suspenzní kultury BY-2 • stanovení intracelulárních esteráz

21. 1. Schema odvození polyembryonální kultury smrku ztepilého (Picea abies /L./ Karst.) a její mikropropagace - pro odvození embryogenní kultury se používají zralá semena, která jsou povrchově sterilizována propráním v 70% etanolu, dále v 20% roztoku SAVO po dobu 20 min a pětkrát propláchnuta ve sterilizované destilované vodě - po sterilizaci semen byla izolována zralá zygotická embrya a umístěna na modifikované poloviční médium LP - indukce(von Arnold and Eriksson, 1981) a pravidelně po čtrnácti dnech pasážována - multiplikace - Petriho misky s embryonálními kulturami byly umístěny ve tmě při teplotě + 23  2o C - vyvinutá raná somatická embrya byla očištěna od zbylého kalusu a udržována na proliferačním médiu při dvoutýdenní pasáži • 1) Indukce somatických embryí zygotická embrya na indukčním médiu = LP/2 + 2,4-D (50 M) + BAP (20 M) + 2% sacharózy po dobu 7 dnů, pak přenést na multiplikační médium LP/2 • 2)Multiplikace somatických embryí očištěná raná somatická embrya (ESE) na udržovacím médiu ve tmě = LP/2 + 9 M 2,4-D + 4,44 M BAP + 2% sacharózy

22. 3)Maturace somatických embryí maturační médium = GD + ABA (30 M = 7,8 mg/l) + 3 % sacharózy ve tmě, doba maturace 5 - 8 týdnů, pasážování po 2 týdnech • 4) Desikace somatických embryí částečná desikace v Petriho miskách s vodou po dobu 21 dnů při teplotě + 27oC ve tmě, (může se zařadit i předdesikační příprava při nižší teplotě) • 5) Klíčení a růst kořene somatických embryí 1. fáze na médiu GD + 0,2% aktivního uhlí + 0,1 M IBA (0,02 mg/l) + 2% sacharózy 3 - 5 týdnů při tlumeném světle 2. fáze na GD/2 médiu + 0,05 M IBA (0,01 mg/l) + 1% sacharózy na světle (80 - 120 mol m-2 s-1 PAR) 4 - 6 týdnů • 6) Převedení rostlinek do substrátu rašelina, písek a agroperlit (1:1:1, v/v/v) nebo substrát Klasman seedlings a písek, vysoká vzdušná vlhkost, postupně se snižuje

23. zásobní roztok v ml na 1 litr média složení a finální koncentrace v médiu v g/l Roztok makroprvků 50 (20x koncentrovaný) NH4NO3 1,2 KNO3 0,95 MgSO4.7H2O0,185 KH2PO4 0,17 CaCl2.2H2O 0,1025 zásobní roztok v ml na 1 litr média složení a finální koncentrace v médiu v mg/l Roztok mikroprvků 0,5 (2000x koncentrovaný) KJ 0,415 H3BO3 3,1 MnSO4.4H2O 11,15 ZnSO4.5H2O 4,3 Na2MoO4.2H2O 0,125 CuSO4.5H2O 0,0125 CoCl2.6H2O 0,0125 Roztok železa 5,0 (200x koncentrovaný) Na2EDTA 18,6 FeSO4.7H2O 13,5 Gerlit (Phytagel) 3,5 Sacharóza 20 • 2. Příprava kultivačního média LP/2 - multiplikacesomatických embryí - LP/2 (Von Arnold, 1987), modifikované (Havel, Durzan, 1996) termostabilní část:

24. zásobní roztok v ml na 1 litr média složení a finální koncentrace v médiu v mg/l Vitamíny 1 (1000x koncentrovaný) thiamin HCl 1,0 kys. nikotinová 0,5 pyridoxin 0,5 glycin 2,0 Casein hydrolyzát 500 Inositol 100 Glutamin 450 2,4 - D 9 2,0 BAP 4,44 1,0 termolabilní část:

25. a b a b c c 250 mm • 3. Práce s kulturami in vitro, růst a pasážování kultur • embryogenní kultura smrku - jednotlivá somatická embrya jsou složena ze tří částí: z tzv. embryonální skupiny, embryonálních tubulárních buněk a embryonálního suspenzoru Rané somatickéembryo smrku ztepilého (klon 2/32) (a) embryonální suspensor, (b) embryonální tubulární buňky, (c) embryonální skupina

26. 45° 90° - růst kultury probíhá tak, že dochází k neustálému oddělování nových tubulárních a suspenzorových buněk směrem od embryonální skupiny k distální části embrya; tvoří se inokulum čítající větší počet embryí - shluky raných somatických embryí jsou kultivovány v Petriho misce na kultivačním médiu. - při pasáži byly odebírány části shluků s vyvinutými skupinami embryonálních buněk o hmotnosti cca 2,5 – 5,0 mg a přenášeny na novou Petriho misku s médiem (znázorňuje červená šipka). 1 d a 0° b c Fotografie shluku ESEpo 14 denní kultivaci in nature z různého úhlu (Fotoaparát Olympus Digital Camera C-4040 ZOOM); (a) 0°, (b) 45°, (c) 90°. (d) Petriho miska se shluky ESE na kultivačním médiu.

27. - mezi nejčastěji využívané metody pro stanovení růstu rostlinných kultur je vážení čerstvé hmotnosti kultury nebo počítání buněk. - případě kultur raných somatických embryí smrku je vhodné využít analýzy obrazu (IA image analysis) - IA nezpůsobuje destrukci nebo kontaminaci studovaného materiálu - při experimentu probíhajícím v čase nemusíme zasahovat do kultivovaného biologického materiálu.

28. c d b Zjištěné plochy jednotlivých SRSE v zadaných jednotkách e a Schéma analýzy obrazu polyembryonální kultury smrku (a) Petriho miska se shluky raných somatických embryí (b) digitalizace obrazu Petriho misky pomocí CCD-kamery (c) a programu Grab-IT (d) zjištění plochyshluků pomocí programu Image-Pro (e) zjištěnévýsledkyjsou dále zpracovány v programu MS Excel

29. suspenzní kultura tabáku BY-2 - suspenzní kultura tabáku linie BY-2 je udržována v kapalném MS mediu obohaceném sacharosou (30 g.l-1), KH2PO4 (0.2 g.l-1), thiaminem (1 mg. l-1) a kyselinou 2,4-dichlorfenoxyoctovou (0.2 mg.l-1) (Nagata, 1992) - suspenze (20 ml) v 50 ml Erlenmeyerových baňkách je kultivována na třepačce (Kühner Shaker, typ LT-W) za těchto podmínek: tma, teplota 271°C, 135 ot.min-1 - subkultivace je prováděna po 3 nebo 4 dnech přenesením 2 respektive 1 ml suspenze do čerstvého media. - hustota suspenze je zjišťována pomocí Fuchs‑Rosenthalovy počítací komůrky - počet buněk zjištěný mikroskopickým pozorováním byl převeden na buněčnou hustotu podle parametrů komůrky - metoda je časově náročná - rutinní sledování růstových charakte- ristik suspenzních kultur také lze realizovat pomocí nepřímého stanovení buněčné hustoty jako např. „objem buněk po centrifugaci“, ovšem zde představuje závažný problém změna morfologie buněk během kultivační doby

30. 4. Odebrání vzorku a jeho příprava pro analýzu • embryogenní kultura smrku - pro stanovení životnosti se odebírá malá část shluku ESE z jeho horní části - pro stanovení intracelulárních esteras se odebírá část shluku ESE o hmotnosti přibližně 100 mg svěží hmotnosti • suspenzní kultura tabáku BY-2 - pro stanovení životnosti se odebírá 37 ml suspenze - pro stanovení intracelulárních esteras se odebírá 0,5 ml suspenze - vzorky suspenze BY-2 a kultury 2/32 ESE byly promyty 50 mM fosfátovým pufrem (pH 8,7) a centrifugovány (360 g, 5 min, 20 °C) - tento krokbyl zopakován třikrát - při stanovení težkých kovů je nutné vzorek promýt v EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) - EDTA náleží do skupiny syntetických komplexotvorných sloučenin a má toxické účinky - využívá se při přípravě modifikovaných kultivačních médií s těžkými kovy – vytváří komplexy s kovy, nedochází k reakcím kovu se složkami média EDTA

31. 5. Stanovení životnosti embryogenní kultury smrku a suspenzní kultury BY-2 - stav kultury je také možné charakterizovat relativním zastoupením životaschopných buněk – viabilitou -pro stanovení viability bylo vyvinuto několik metod -nějčastěji se provádí tzv. „dye exclusion test“, založený na selektivní permeabilitě cytoplazmatické membrán - dále je možné sledovat funkční metabolizmus buněk (jednu z možností představují intracelulární esterasy) • Postup při zjišťování životnosti embryí a buněk suspenze tabáku - odebrání části shluku raných somatických embryí - vytvoření suspenze s 37 μl destilované vody, 10 μl propidium jodidu a 3 μl fluoresceindiacetátu (fluorescenční barviva) - propidium jodid je propouštěn přes cytoplazmatickou membránu dovnitř buňky a způsobuje ve fluorescenčním mikroskopu u mrtvé buňky červené fluorescenční zbarvení - fluoresceindiacetát byl v živých buňkách štěpen na octan a fluorescein, který vydával zelené fluorescenční zbarvení - příprava mikroskopického preparátu a jeho sledování pomocí inverzního fluorescenčního mikroskopu Olympus AX 70

32. a b 1 2 3 III 4 V V I I N N C C c 250 mm suspenzní kultura tabáku BY-2 a ESE smrku ztepilého Jednotlivé buňky buněčné suspenze sledované pomocí konfokálního mikroskopu, (1) v šedém poli, cytoplazma (C), vakuoly (V), jádro (N). (2) zbarvené pomocí fluoresceindiacetátu. (3) ESE smrku obarvená flourescenčními barvivy FDA/PI. (4)ESE smrku v šedém poli (a) embryonální suspensor, (b) embryonální tubulární buňky, (c) embryonální skupina