病毒学（ Virology ）

8. 病毒学（Virology） 病毒学是研究病毒这一特殊生命形式的性质及其与宿主相互作用的关系的自然学科，是跨生物学、医学、农学的交叉学科，是分子生物学研究领域的前沿学科。

9. 第一章 绪论 第一节 病毒学研究的对象与任务 一、病毒学研究的对象 病毒（Virus）是一种特殊的生命形式，是一种极为简单的生命形式。

10. （一）病毒的特点 1、病毒结构简单 (1)不具有细胞结构 (2)只具有一种核酸（DNA或RNA） (3)不含核糖体和完整的酶系统，也不具有能量合成和代谢系统。 2、独特的繁殖方式 (1)不具有双分裂 (2)以复制方式进行繁殖 3、绝对的细胞内寄生

11. 4、病毒的二重性 (1)病毒存在形式的二重性 *细胞外具有感染性的颗粒形式 *细胞内具有繁殖性的基因形式 (2)病毒结构形式的二重性 *完全病毒与缺损病毒（defect virus） *病毒与假型病毒(pseudo type virus)、假毒粒(pseudovirion) *病毒颗粒与空壳 (3)病毒来源的二重性 * 外源性病毒 从细胞外到细胞内在细胞间水平传播的病毒 * 内源性病毒 在宿主发育早期感染宿主，病毒基因组整合于宿主基因组并与其同步复制，随细胞分裂垂直传递给子代细胞，但因其受宿主细胞控制，病毒基因组只能部分表达，故没有子代病毒产生，且对宿主一般不造成伤害。

12. （二）病毒的定义 病毒是占据一定生境，并具有独立于其宿主进化史的绝对细胞内寄生物，其基因组（DNA或RNA）被其自身编码的蛋白质外壳所包围。

13. (三）、病毒的宿主范围 • 宿主范围：病毒所能感染的宿主和宿主细胞的种类 • 按宿主种类划分

14. Euvirus Virus Subvirus Viroid Satellite agent Satellite RNA Satellite virus Prion

16. Plant Viruses Insect Viruses Animal Viruses 虫媒病毒（arbovirus） 以蚊、蜱、螨、白蛉等节肢动物为媒介，在脊椎动物中广泛传播的病毒。

17. （四）、病毒的起源 • 三种假说： • 病毒起源于细胞的DNA/RNA • 病毒的退行性进化假说 • 病毒起源于具有复制能力的寡聚核苷酸

19. 四、病毒学研究任务 • 理论方面：推进现代生物学的发展 • 应用方面： • 控制和消灭危害人类健康和社会发展的病毒危害 • 利用病毒对有害生物进行生物防治 • 促进生物高新技术的发展

20. 第二章 病毒学研究的基本方法

21. 一、病毒的分离 （一）标本的采集与处理 （二）标本的接种： 实验宿主（动物、植物或细菌）， 　　　 　　　　　鸡胚或细胞培养 （三）病毒存在的认定 1、系统症状

22. 2、局部反应 (1)噬菌体—噬菌斑(plaque) 噬菌体感染生长在营养琼脂平板上的细菌所形成的，具有一定大小和形状的透明区域。 (2)动物病毒—蚀斑或称空斑(plaque) 　动物病毒感染单层细胞培养所形成的局部病损区域，系由病毒的致细胞病变作用所引起．

23. 致细胞病变作用（Cytopathic effect ， CPE） ： 病毒感染细胞培养引起的细胞显微表现的改变，如细胞聚集成团，肿大、园缩、脱落、细胞融合形成多核细胞、细胞内出现包涵体（inclusion body），乃至细胞裂解等 （３）植物病毒－坏死斑或称枯斑（necrosis spot） 植物病毒感染敏感植物叶片所形成的局部病损区域．

24. （四）盲传（blind passage） 将取自经接种而末出现感染症状的宿主或细胞培养的材料，再接种于新的宿主或细胞培养，以提高病毒的毒力或效价．

25. 二、病毒的纯化 (一)病毒的纯化 1.病毒纯化的标准 (1)纯化的病毒制备物应保持感染性 (2)纯化的病毒制备物应具有均一性 病毒制备物均一性检查的方法 包括：电镜检查、超速离心、电泳和免疫学方法

26. （二）病毒纯化的方法 1,病毒纯化方法的依据 (1)病毒颗粒具有一定的大小和密度，在离 心场中能以一定的沉降速率沉降 (2)病毒颗粒的主要化学组成为蛋白质 2.病毒纯化的方法 包括:超速离心,沉淀法,凝集技术,液态两相分配系统,有机溶剂萃取,层析和电泳等

27. 三、病毒的测定（assay of vrvuses） 病毒的测定即病毒的定量分析 (一) 病毒的物理颗粒计数 1. 电镜计数，将待测病毒样品与已知数目的聚苯乙烯乳胶颗粒均匀混合后置电镜观察，统计病毒颗粒数目与乳胶颗粒数目，根据两类颗粒数目之比即可计算出待测样品中的病毒颗粒数目。

28. 2.血细胞凝集试验 血细胞凝集作用（Hemagglution） 许多动物病毒的包膜蛋白或外壳蛋白在一定条件下（温度、pH、离子浓度等）能引起体外的一定种类的脊椎动物红血球细胞凝集，此即血细胞凝集作用。 血细胞凝集试验 由于具有血凝性质的病毒所能凝集血细胞的量与病毒浓度成正比，根据这一原理设计的血细胞凝集试验即可用于病毒定量测定。

29. 待测病毒样品 2倍稀释 1:1 1:10 1:20 1:40 1:80 1:160 1:320 1:640 1:1280 1:2560 每孔分别加入等体积一定浓度的红球血细胞 置室温孵育一定时间 观察结果并计算病毒血凝效价

30. （二）病毒的感染性测定（assay of viral infectivity） *感染性测定测定因感染所引起宿主或细胞培养某一特异性感染反应的病毒数量。 *感染单位（infectious units, IU）:引起宿 主或宿主细胞培养一定特异性反应的病毒最小剂量　 　　*效价（title）：单位体积（ml）病毒原液所含的病毒感染单位的数目（IＵ/ml）。

31. 1、 噬（蚀）斑测定 （1）噬菌体的噬菌斑测定，琼脂叠层法（agar layer method） 　　一定量的经系列稀释的噬菌体悬液分别与高浓度的敏感细菌，以及半固体营养琼脂均匀混合后，塗布在已铺有较高浓度营养琼脂的平板上，经过孵育培养，在延伸成片的细菌菌苔上出现分散的单个噬菌斑。根据病毒的一次击中（one-hit）动力学性质，一个有感染性的病毒即可引起一个细胞的感染并形成一个噬斑，并且其数目与样品中有感染性的噬菌体颗粒数量成正比，故统计噬斑数目后即可计算出噬菌体悬液效价，并以噬斑形成单位（plague forming units ， PFU）/毫升（ml）表示。

32. ２、动物病毒的蚀斑测定 　　空斑测定 　　转化测定 　　合胞体计数 ３、植物病毒的环死斑测定 　　半叶法

33. ２、终点法（end point method） 取等体积的经倍比稀释的病毒系列稀释液分别接种大量同样的试验单元（如实验动物、鸡胚或细胞培养），经过一段时间孵育后，以试验单元群体的半数（50%）个体出现某一感染反应的病毒剂量，来确定病毒样品的效价，称做半数效应剂量，并以50％试验单元出现感染反应的病毒稀释度的倒数的对数值表示。 根据试验单元及感染反应的性质分为： 半数致死剂量（50% lethal dose, LD50） 半数感染剂量（50% infective dose, ID50） 半数组织培养感染剂量（50% tissue culture infective dose, TCID50）

34. 终点测定实验记录举例

35. 根据Reed和Muench方法 半数效应剂量(LD50, ID50或TC ID50) =50%感染率的高临界稀释度倒数的对数＋距离比×稀释系数的对数． 上式中： 距离比＝ 在上例中，距离比＝71-50/71-13=0.36 稀释系数为10 故LD50=log1/10-3+0.36Xlog10=3.36 即该待测样品的LD50效价是10-3.36

36. 四、病毒的鉴定 （一）根据病毒感染宿主的范围及感染表现的鉴定 1、病毒感染的宿主范围 宿主谱 2、病毒感染的症状表现 感染宿主机体——疾病症状 感染鸡胚——在鸡胚绒毛尿囊膜上形成痘疱（pock）的形态。 感染细胞培养——致细胞病变效应表现 3、病毒的传播途径与传播媒介

37. （二）病毒的理化性质鉴定 1、电镜技术 2、分析超速离心技术 (三)病毒对理化因子敏感性的鉴定 （1）病毒对DNA合成抑制剂的敏感性试验 （2）脂溶剂敏感试验 （3）耐酸性试验 (4) 温度敏感试验 (5) 紫外敏感试验

38. (四)红细胞凝集性质的鉴定 不同的具有血凝活性的病毒，其凝集谱、发生凝集反应的条件（温度、pH）都有可能不同,据此可以对病毒进行鉴定。 (五)病毒的免疫鉴定 免疫沉淀反应，凝集反应，酶联免疫吸附测定，免疫莹光技术，免疫电镜技术、放射免疫技术、单克隆抗体技术等。 血凝抑制试验：特异性的病毒抗体与病毒表面有凝集活性的表面蛋白结合，可抑制血细胞凝集反应发生。

39. 中和试验： 在病毒的中和作用（neutralization）性质上建立，即某些特异性的病毒抗体与病毒作用后，能够使其失去感染性，抑制病毒的繁殖。这类病毒抗体称做中和抗体（neutralizing Abs） 。并且一种病毒的感染性只能被其特异性的中和抗体中和，而中和一定量的病毒的感染性必须有一定效价的抗血清。

40. (六)分子生物学方法 *变性与不变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳 *蛋白质肽图与N末端氨基酸分析 *核酸的酶切图谱与寡核苷酸图谱分析 *分子杂交 *序列测定 *聚合酶链反应（PCR）等

41. 第三章 毒粒的性质 第一节 描述毒粒性质的结构术语 一、毒粒（Virion） 1、毒粒是一团能够自主复制的遗传物质（DNA或RNA），它被自身编码的蛋白质外壳所包围，有的还有一层附加膜，以保护其遗传物质免遭环境破坏，并作为将其遗传物质从一个宿主细胞传递给另一个宿主细胞的载体。 2、毒粒的基本构成：一个核酸分子（DNA或RNA） 蛋白质外壳（由许多相同的蛋 白质分子构成） * 有的病毒含有多个核酸分子 * 有的病毒蛋白质外壳由数种不同的蛋白质分子构成 * 有的病毒蛋白质外壳外还有一层膜结构 * 有的病毒的多个核酸分子被分别包装在不同的颗粒中

42. 3、分段基因组（segmented genome） 病毒基因组由数个核酸分子构成，只有这些核酸分子同时存在病毒才具有感染性，其各个核酸分子称之为节段（segment）。 4、多分体病毒（multicomponent viruses）: 具分段基因组的病毒各个核酸节段分别包装在多个颗粒中，只有这些颗粒同时存在病毒才能够复制，个别颗粒感染病毒不能复制，多分体病毒主要见于植物RNA病毒中。

43. 二、壳体（capsid），又称衣壳，其同义语是外壳（coat）二、壳体（capsid），又称衣壳，其同义语是外壳（coat） 包围着病毒核酸及其结合蛋白的蛋白质鞘(shell)。 三、蛋白质亚基（protein subunit），其同义语是原体（protomer）或结构单位（structure unit） 以次级键结合构成病毒壳体的蛋白质单体。结构简单的病毒壳体仅由大量相同的蛋白质亚基构成，一些复杂的病毒壳体可能由多种不同的蛋白质亚基构成。

44. 四、壳粒（capsomer），又称子粒，其同义语是形态学单位（morphological unit） 在病毒的二十面体壳体构成中，一定数量的蛋白质亚基以特殊方式聚集形成的，在电镜下可见的结构。 蛋白质亚基 聚集 壳粒 聚集 二十面体壳体 五聚体（pentamer）:由5个蛋白质亚基聚集形成 六聚体（hexmer） :由6个蛋白质亚基聚集形成

45. 五、核心（core） 由病毒核酸及其结合蛋白组成，并被壳体包围的毒粒的中心部分。一些复杂病毒的核心结构较为复杂，这类病毒的核心常称做类核（nucleoid） 六、核壳（nucleocapsid），又称衣壳 壳体与核心一起构成的复合物，一些简单的病毒的毒粒就是一个核壳结构。 七、包膜（envelope），又称囊膜 　　 包膜是病毒核壳外的膜结构，系病毒以芽出方式（budding）成熟时，由细胞膜衍生而来的脂双层膜，其中的膜蛋白是病毒基因编码的。 八、钉状物（spike） 病毒表面向外凸出的突起,多见于有包膜病毒的包膜表面,包膜表面的钉状物称做包膜突起（peplomer）

46. 第二节　毒粒的化学组成 　毒粒的基本组成包括：核酸 　　　　　　　　　　　蛋白质 　　　　　　　　　　　脂类 　　　　　　　　　　　碳水化合物 其它组分 一、病毒的核酸 （一）核酸是病毒的遗传物质 DNA是DNA病毒的遗传物质 Hershey chase (1952) E.Coliphage T2 搅拌试验 RNA是RNA病毒的遗传物质 Fraenkedl –conet, singer(1955) Gierer , schrcmm (1957) Tobacco mosaic virus体外重建试验

47. (二)病毒核酸的碱基组成含量和类型 1、病毒核酸的碱基组成 病毒DNA的碱基组成： A、T、G、C 病毒RNA的碱基组成： A、T、G、U 有些噬菌体的DNA中含有稀有碱基 Bacillus subtilis phage SP8 U>C E.coli phage T4 5-HMC>C 2、含量和分子量 不同的病毒核酸含量不同 T-even phage 50% TMV 5% Influenzavirus 1% 不同的病毒核酸的分子量差异很大 细小病毒 （Parvoviruses） 1.5x106 痘病毒 (Poxviruses) 150x106

49. 2、末端重复（terminal repeats） 基因组核酸分子两端存在的相同核苷酸序列 3、倒转末端重复（inverted terminal repeats） 基因组核酸分子两端存在的互补核苷酸序列 ABCA`B`C` ABC C`B`A` ABCA`B`C` 或ABC C`B`A` A B C 或 A B C A B C A B C 或

50. 4、循环排列（ciraular permutation） 多个病毒颗粒中随机包装的双链DAN分子有相同的基因顺序，但末端的序列有所不同 ABCDEFGAB BCDEFGABC CDEFGABCD 5、5’末端的帽子结构（Cap Strueture） 大多数真核正链RNA（+RNA）病毒的基因组RNA和双链RNA病毒的基因组RNA的正链的5`端均有5`—5`结合的7-甲基化鸟苷酸残基封闭结构，其RNA链的第一个核苷酸亦甲基化，这种完全甲基化的末端寡核苷酸（m7G5`-ppp5`NmpNp）即称做为帽子结构。