Dipresentasikan oleh: Anastasia Riany (10503008) Anna Sanawati (10503058)

New insights into allosteric mechanisms from trapping unstable proteinconformations insilica gelsCristiano Viappiani, Stefano Bettati, Stefano Bruno, Luca Ronda, Stefania Abbruzzetti, AndreaMozzarelli, and William A. EatonPNAS 101(2004) 14414-14419 Dipresentasikan oleh: Anastasia Riany (10503008) Anna Sanawati (10503058)

Pendahuluan • Mekanisme Monod-Wyman-Changeux (MWC) • Pengikatan oksigen oleh hemoglobin  kooperatif • Perubahan afinitas oksigen

Tujuan Menentukan kinetika pengikatan ligan dan kesetimbangan hemoglobin yang diperangkap silika gel dalam struktur kuartener T atau R

Hemoglobin • Heme ; globin • Tetramer • Metalo protein • C2952H4664N812O832S8Fe4 • Terdapat dalam sel darah merah

Skema Stuktur Hemoglobin • Perubahan konformasi kuartener R dan T rotasi 15

Proses pengikatan dan pelepasan O2 • Mekansime kooperatif • Melalui perubahan konfomasi sterik • Kurva pengikatan oksigen  sigmoid

Kurva Pengikatan O2 • Dari penelitian Mozzarelli, et.al., 1997 diketahui pengikatan hemoglobin terhadap O2 dalam gel dan kristal  non kooperatif

Penyiapan Sampel • T- : • Hepes/EDTA + tetrametil ortosilikat • Deoksigenasi dengan menyemprotkan helium selama 90 menit • Deoksihemoglobin, Hepes, natrium ditionin, EDTA • Gelifikasi selama 10 menit • T+ : • Allosterik efektor : inositol heksafosfat, bezafibrat, ion klorida

Efektor Hemoglobin • Inositol heksafosfat • Asam phitat • C6H18O24P6 • Bezafibrate • C19H20NClO4

Pengukuran Kesetimbangan dan Kinetika • Kurva pengikatan O2 diukur dengan mikrospektrofotometer dan elektroda O2 • Studi kinetik, • Q-swicthed Nd : YAG laser (Ar+) pada 532 nm untuk fotolisis • Fotodioda untuk deteksi

Kinetika Pengikatan Kembali Ligan (1) • Pada R gel, terdapat 2 fasa : 100 ns dan 100 µs • Pada T+ gel, terdapat 1 fasa : 10 ms

Kinetika Pengikatan Kembali Ligan (2) • Pada setiap kondisi, fraksi utama pada struktur kuartener T mempunyai kinetika seperti struktur kuartener R

Hasil Geminasi pada T- gel • Pada saat kejenuhan awal 100%  ada kenaikan amplitudo • Pada kejenuhan awal 50%  tidak ada perubahan

Eksperimen Pengikatan O2 pada Kesetimbangan • Pada T- gel, afinitas meningkat karena terjadi perubahan struktur tersier t-r, tetapi struktur kuartener tetap T

Eksperimen fotolisis CO • Pada T+ gel, subunit yang berikatan dengan CO berada pada konformasi t • Pada T- gel, pengikatan CO mengubah beberapa fraksi subunit menjadi korfomasi r • Setelah fotodisosiasi, konformasi subunit r tetap

Simulasi Kinetika pada Kesetimbangan • Disosiasi oksigen lebih cepat daripada disosiasi CO O2 CO

Kesimpulan • Adanya subunit sejenis R dalam struktur tersier T • Menjelaskan sifat kesetimbangan dan kinetika hemoglobin dalam kristal, larutan, dan gel • Saran : • Mengaplikasikan model TTS

Terima Kasih

Dipresentasikan oleh: Anastasia Riany (10503008) Anna Sanawati (10503058)