基因治疗 (gene therapy) 有关概念基因治疗的基本程序基因治疗策略和技术方法基因治疗的应用研究

第二节基因治疗 • 基因治疗 (gene therapy) 有关概念 • 基因治疗的基本程序 • 基因治疗策略和技术方法 • 基因治疗的应用研究

一. 基因治疗（Gene therapy ）有关概念 基因治疗（Gene therapy ）：指在基因水平上治疗疾病的方法。包括基因置换、基因修正、基因修饰、基因失活、引入新基因等。

体细胞基因治疗：somatic gene therapy 改变患者体细胞的基因组成、结构或基因表达水平以达到治疗疾病的方法。生殖细胞基因治疗：将正常基因转移到患者生殖细胞中，使其发育为正常个体，从根本上治疗遗传病的方法。

二. 基因治疗的基本程序 （一）目的基因的选择和制备（二）基因的导入方式体内法（in vivo），原位法（in situ），回输法（ex vivo）（三）靶细胞的选择目前基因治疗中禁止使用生殖细胞作为靶细胞，而只能使用体细胞。可选择的细胞有淋巴细胞、造血细胞、皮肤成纤维细胞、肝细胞、血管内皮细胞、淋巴细胞、肌肉细胞和肿瘤细胞等。（含量丰富、易培养、寿命长）（四）基因的转移（五）转基因细胞的筛选和导入基因的鉴定

基因治疗基本程序（回输法） 将治疗基因克隆入合适表达载体以病毒核酸为载体治疗基因转入靶细胞治疗基因插入靶细胞基因组筛选，再回输入病人身体

基因转移的方法 • 基因转移 (gene transfer):外源基因导入细胞（包括体外培养或体内细胞、真核或原核生物细胞）的过程。可用转导、转染、感染、电穿孔、显微注射或基因枪等手段。 • 基因转移途径分两类：病毒学方法非病毒学方法

病毒学方法：以病毒作为载体转移 • 逆转录病毒基因组经过改造后作为载体 ( retrovirus vector, RV) • 腺病毒(adenovirus, Ad)基因组可作为载体携带治疗基因。（双链DNA病毒） • 腺病毒相关病毒（adenovirus associated virus,AAV)载体适合治疗基因的稳定长效表达。 • 单纯性泡疹病毒(herpes simplex virus, HSV) 载体适合将治疗基因导入神经细胞。（双链DNA病毒）

病毒介导基因转移（Viral mediated transfer） 是通过病毒为载体（vector），将外源基因通过重组技术与病毒重组，然后去感染靶细胞。感染细胞重组病毒

逆转录病毒（retrovirus）RNA病毒 目前应用最多、最成功。病毒感染细胞后，其基因组RNA经逆转录产生双链DNA拷贝，插入宿主基因组DNA形成前病毒（provirus），前病毒转录产生的正链既是病毒RNA，再与前病毒编码的外壳蛋白包装成新的病毒颗粒。前病毒宿主基因组DNA 正链逆转录病毒感染宿主细胞的机制

小鼠白血病病毒（Mo-MLV）基因组结构特点： LTR：长末端重复序列 U3=增强子，R=启动子，U5=转录起始、终止信号位点。 Ψ=病毒包装信号， gag =基质蛋白、核衣壳， pol=逆转录酶、蛋白酶、整合酶， env=外壳蛋白、包膜蛋白。

LTR therapeutic gene LTR 逆转录病毒介导的基因转移系统逆转录病毒载体结构基因被删除，保留包装信号（ψ），带有抗性基因（neo），具有适当的酶切位点。它可以克隆并表达外源基因，缺失病毒颗粒包装蛋白基因，不能自我包装成有增殖能力的病毒颗粒。

gag pol env 辅助细胞株（提供病毒包装蛋白）它由另一种缺陷型逆转录病毒感染构建而成。该细胞株能合成包装蛋白，用于逆转录病毒载体包装。由于缺乏包装信号，本身不能被包装成病毒颗粒。

辅助细胞株 逆转录病毒载体具感染性的逆转录病毒载体颗粒逆转录病毒介导的基因转移系统

逆转录病毒载体优点： • 高效感染靶细胞，感染率可达100% • 病毒基因和所载的外源治疗基因都可能表达 • 宿主范围广，可同时感染大量细胞并长期存留

缺点 • 病毒基因容量有限，一般只能插入7kb左右片段； • 病毒随机插入靶细胞基因组中，因病毒具有强大的启动子和增强子，能使插入点附近的基因过度表达或失活，插入的外源基因可能不适当的表达； • 逆转录病毒有致癌作用，可能使受体细胞癌变。

非病毒学方法 • 脂质体（liposome)介导基因转移利用阳离子脂质体单体与DNA混合后，可以形成包埋外源DNA的脂质体，与细胞一起温育，可通过细胞内吞作用将外源DNA(目的基因）转移到细胞内。 • 细胞表面受体介导基因转移 * 将DNA与已证明有细胞或组织亲和性的配体偶联，即可使其具有细胞靶向性。 • 直接注射进行基因转移直接将裸露基因DNA注入动物肌肉或某些器官组织内。 • 其他方法介导基因转移 *

脂质体（liposome）介导基因转移 脂质单体：由脂质双分子层组成的封闭囊泡，无毒、无免疫原性。缺点：转染效率低，转染基因表达时间短暂。

受体介导基因转移 将含有目的基因的重组质粒和靶细胞表面受体能识别的特异性多肽（配体）形成复合物，通过细胞内吞途径达到转移基因的目的。特点：具有细胞组织专一性、配体只能够被一些特殊的细胞吞噬；转移效率高。 *

显微注射法（microinjection ） 利用显微操作把目的基因直接注入靶细胞或细胞核

例：转基因动物的制备 重组基因 DNA 微注射（体外）小鼠受精卵回植假妊娠仔鼠动物模型：转基因鼠 (每个鼠细胞中都含有外源基因，按孟德尔方式遗传)

电穿孔法（electroporotion） 将细胞置于高压脉冲电场中，通过电压使细胞产生可逆性的穿孔。周围基质中的外源DNA可渗进细胞，进而表达。瞬间细胞 -------- 细胞膜核膜通透性增加高压脉冲外源DNA渗入细胞

化学法 磷酸钙沉淀法：目的基因与磷酸钙等物质混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，粘附于细胞表面，通过细胞内吞作用被捕获，并整合到受体细胞基因组中，在适当条件下得以表达。

磷酸钙+DNA → 混合微细颗粒 ↓ 沉淀反应20~30min ↓ 细胞在沉淀物中暴露 5~24h 方法简单，但转化效率低。

微粒子轰击法 • 利用金属钨和金的亚微粒能吸附DNA，并将其包裹起来形成微粒，通过物理途径获得高速度，微粒瞬间既可进入靶细胞，达到转移目的基因的目的，而不损伤靶细胞。 • 该方法可使目的基因在皮肤、肝、胰、胃及乳腺等细胞中表达。

适合基因转移的靶细胞 在目前条件下，基因治疗仅限于体细胞。为了防止给人类自身可能造成永久性损害，国际上严禁进行生殖细胞的基因治疗操作。适合基因转移的体细胞有：造血细胞皮肤成纤维细胞肝细胞血管内皮细胞淋巴细胞肌肉细胞肿瘤细胞其他细胞（心肌细胞、脾细胞）

靶细胞的选择 靶细胞是指接受外源Gene的体细胞，选择靶细胞的原则是： • 易于由人体分离又便于输回体内； • 便于体外培养和进行遗传技术操作； • 易于受外源遗传物质转化； • 具有增殖优势，生命周期长（能存活几月至几年，或整个生命周期）。

体细胞的基因治疗 • 正常基因转移至体外培养的体细胞，有效表达后，再回输到体内。 • 正常基因导入靶细胞，定位整合到染色体上，准确的替换异常基因，是理想的措施。 • 随机整合，非特定座位，只要有效的表达即可达到治疗的目的。 • 体细胞基因治疗理论上不必矫正所有的体细胞。

基因置换（gene replacement)：缺陷基因进行精确原位修复是指将特定的目的基因导入特定的细胞，通过定位重组，以导入的正常基因置换基因组内原有的缺陷基因。目的是矫正缺陷基因，不涉及基因组任何改变。必要条件：对导入的基因及其产物有详尽的了解；外来基因能有效地导入靶细胞；导入基因能在靶细胞中长期稳定存在；导入基因能有适度水平的表达；基因导入的方法及所用载体对宿主细胞安全无害。三. 基因治疗策略和技术方法

定位重组（homologus recombination）: 外源基因和染色体上的基因在同源序列间发生重新组合而将外源基因定位插入细胞的染色体上。

通过定位重组插入珠蛋白基因 δ β 正常基因座位 BstXI Xba I Xba I XbaI BstXI △β 带有珠蛋白基因的质粒 C neo δ Δβ β neo 重组后，插入外源基因片段带有——neo基因（新霉素抗性基因），重组后的细胞在含有neo 的培养基中生长，没有插入外源基因的细胞死亡，将有重组的细胞筛选出来。

基因添加（gene augmentation)：通过导入外源基因使靶细胞表达原来不能表达的蛋白。有两种类型：一. 是针对特定的缺陷基因导入其相应的正常基因，并使之整合到基因组中，而细胞内缺陷基因并未去除，通过正常基因的表达产物，补偿缺陷基因的功能；二. 是向靶细胞中导入靶细胞本来不表达的基因，利用其表达产物达到治疗疾病的目的。

基因干预（gene interference ) 是指采用特定的方式抑制某个基因的表达，或者通过破坏某个基因的结构而使之不能表达，以达到治疗目的。例如反义核酸、干扰RNA或核酶技术等。

基因干预技术 基因干预技术主要用于干扰特定细胞的mRNA转录和翻译，在调控基因表达、特别是在抑制一些有害基因的表达或失控基因的过度表达方面取得了很大进展。干预基因表达作用得到证实，但体内应用还存在许多技术难点，目前仍以体外实验研究为主。

基因干预采用方法 反义RNA技术（antisense RNA)：要将合成的反义RNA用于体内基因治疗，必须解决两个关键问题： • 专一性转移问题即如何专一性地对病变细胞进行调控，而不影响其他正常细胞。 • 反义RNA进入靶细胞前的降解问题反义 RNA抗RNase能力不强，易被降解。受体介导的反义RNA转移技术是解决上述两个问题的一条很有希望的途径。

核酶的作用机制与一般的反义RNA相比，核酶具有较稳定的空间结构，不易受到RNA酶的攻击。更重要的是，核酶在切断mRNA后，又可从杂交链上解脱下来，重新结合和切割其它的mRNA分子。

核酶技术用于基因治疗 可以基因治疗为目的设计核酶；核酶切割特定mRNA而产生更强的基因干预效应。三链DNA技术可用于基因治疗一类含10bp±的DNA单链（脱氧寡核苷酸，ODN）,它们可以识别并结合到染色体双链DNA的特定位点,形成一段三链DNA（Ts-DNA ）。若将此ODN连接到核酸内切酶上，ODN可将核酸内切酶携带到DNA的特定位点上，借形成Ts-DNA从而对DNA进行选择性剪切。阻止基因转录或DNA复制。

RNA干扰技术（RNA interference, RNAi) siRNA（Small interfering RNA ）: 是一种小RNA分子（21-25核苷酸），由Dicer（RNAase Ⅲ家族中对双链RNA具有特异性的酶）将外源的dsRNA加工而成。siRNA激发与之互补的目标mRNA的沉默。外源性

内源性 miRNA（micro RNA）：由高等真核生物基因组编码的，含有茎环结构的miRNA前体（pre-miRNA），经过Dicer加工之后的一类非编码的小RNA分子，类似于siRNA的分子，miRNA通过和靶基因mRNA碱基配对引导沉默复合体（RISC）降解mRNA或阻碍其翻译，在调控发育过程中有重要作用。

RNAi研究的一般技术路线

siRNA可用于有异常基因表达的恶性肿瘤 如用siRNA可以阻碍肿瘤发生所必须的K- ras蛋白表达而抑制肿瘤。 siRNA可用于病毒性疾病的基因治疗如用siRNA抑制HIV某些基因表达，阻碍 HIV在细胞内复制。

自杀基因（suicide gene）技术： 导入基因编码的酶能使无毒性的药物前体转化为细胞毒性代谢产物，诱导细胞产生自杀效应，清除肿瘤细胞。旁观者效应自杀基因的作用机制

四. 基因治疗的应用研究 背景知识：世界上第一个正式被批准用于基因治疗的病例是：先天性腺苷脱氨酶（ADA)缺乏症 1990年9月美国 Dr. Blaese 成功将正常人的ADA基因植入ADA缺陷病人的淋巴结内，完成了世界上首例基因治疗试验。

（一）遗传病的基因治疗研究 人类遗传病4000多种，发病率为40-50%，必须符合以下要求的遗传病才可考虑开展基因治疗研究：（30余种） • 在DNA水平上明确其发病原因及机制； • 单基因遗传病，而且属隐性遗传； • 该基因的表达不需要精确调控； • 该基因能在一种便于临床操作的组织细胞中表达并发挥其生理作用； • 该遗传病不经治疗将有严重后果。

几种已经或可望在临床进行基因治疗的人类单基因遗传病几种已经或可望在临床进行基因治疗的人类单基因遗传病 • 腺苷脱氨酶(ADA)和嘌呤核苷磷酸化酶（PNP) 缺乏症； • 血友病B：针对凝血因子Ⅸ基因；中国科学家薛京伦等1991年12月成功进行了血友病B的基因治疗。将携带凝血因子Ⅸ基因的巨细胞病毒载体导入患者自身皮肤的成纤维细胞——经体外培养---- 再植入患者皮下----患者血浆中凝血因子Ⅸ浓度上升，凝血活性改善。

苯丙酮酸尿症和其他先天性代谢性缺陷病： 肝内苯丙酮酸羟化酶（PAH)缺乏； • 箂纳（Lesch-Nyhan)综合征又称自毁容貌综合征：次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)缺乏； • 家族性高胆固醇血症：因低密度脂蛋白（LDL)受体基因突变所致。

1. 联合免疫缺陷综合征的基因治疗 （首例人类基因治疗成功例子） ADA缺乏症-——致死性疾病，患者由于腺苷酸脱氨酶（ADA）缺乏。

ADA-Gene + vector （逆转录病毒） 重组分子患者T淋巴C IL-2刺激C分裂导入细胞生长分裂 10天 Gene表达回输患儿体内 1~2月治疗一次, 10个月患儿体内ADA水平达正常人的25%

2. 乙型血友病 XR ，临床表现，易出血，凝血时间长，轻伤、小手术后常出血不止。发病率为1/30000。患者凝血因子Ⅸ缺乏，Ⅸ因子基因定位在Xq26.3~q27.2。例如：我国学者薛京伦实施的FⅨ的基因治疗。

逆转录病毒载体+ FⅨcDNA 重组体 5`LTR FⅨ neo SV PSO LTR 3` ①导入仓鼠细胞（CHO ）→FⅨ表达； ②导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）→FⅨ表达； ③91年，导入乙型血友病患者皮肤成纤维细胞（体外培养）→回植病人皮下→FⅨ基因表达，FⅨ基表达水平达正常人的5%。是我国基因治疗成功的例子。

基因治疗 (gene therapy) 有关概念基因治疗的基本程序基因治疗策略和技术方法基因治疗的应用研究