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细胞凋亡研究新进展及凋亡检测技术

细胞凋亡研究新进展及凋亡检测技术. 赵万洲 博士 南京凯基生物科技发展有限公司 2010.10.28. Apoptosis - (Gr. "falling") a process seen in multicellular organisms, by which specific cells are killed and removed for the benefit of the organism. Kerr, J.F.R., Wyllie, A.H. and Currie, A.R. 1972. Br. J. Cancer 26:239.

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细胞凋亡研究新进展及凋亡检测技术

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  1. 细胞凋亡研究新进展及凋亡检测技术 赵万洲 博士 南京凯基生物科技发展有限公司 2010.10.28

  2. Apoptosis - (Gr. "falling") a process seen in multicellular organisms, by which specific cells are killed and removed for the benefit of the organism. Kerr, J.F.R., Wyllie, A.H. and Currie, A.R. 1972. Br. J. Cancer 26:239.

  3. 细胞凋亡（apoptosis） • 概念：程序化细胞死亡（Programmed cell death，PCD）是多细胞有机体为调控机体发育、维护内环境稳定，由基因控制的细胞主动死亡过程。

  4. 凋亡的研究历史 a、凋亡概念的形成和形态学的研究(1972） 1965年发育生物学家Lockshin在研究硪发育过程中首次提出程序化死亡（programmed cell death ）概念。 1971年澳大利亚生物学家Kerr用皱缩死亡来区别经典的细胞坏死。 1972年Kerr等在英国癌症杂志发表论文，首次提出细胞凋亡(apotosis)的概念。宣告了对细胞凋亡的真正探索的开始。 b、DNA的降解和内源性核酸内切酶的参与。(1987） c、蛋白质水解酶活化的研究(1995) d、细胞膜的变化(1997) e、线粒体的变化和分子生物学的研究(1998-) 1) 相关基因及调控 2）信号转导 3）各种分子及其相互作用及相互关系 4）疾病机制的阐明，以及新疗法的探索及问世。 Science. 2005 Oct 7;310(5745):66-7.

  5. 细胞凋亡的研究意义 • 在胚胎发育过程中：通过凋亡可清除对机体无用的、多余的、发育不正常的、以及有害的细胞。 • 在成年机体中：通过凋亡消除衰老的细胞并代之以新生的细胞；清除体内受损伤的或有癌前病变的细胞，防止癌变；凋亡还参与构成机体的防御机制。

  6. 细胞凋亡异常是某些疾病发病的重要原因： • 如凋亡不足引发恶性肿瘤、病毒性疾病和自身免疫疾病；而凋亡过量则可能产生艾滋病、重症肝炎与老年性痴呆症、帕金森氏症等，因此研究细胞凋亡已成为生命科学、医学病理学、药理学等学科的热点领域。 • 细胞凋亡的研究加深人们对生命现象及某些疾病的认识。

  7. Kono H, et al, Nature Immunology, 2008,8,279-289

  8. Normal Apoptosis Necrosis

  9. 细胞凋亡的信号转导通路 • 死亡受体信号通路 • 线粒体信号通路 • 细胞凋亡的基因调控

  10. Apoptosis----------Death Receptor Signaling

  11. TNF receptor superfamily

  12. Fas TNF-R1 Mit Cyt c Caseff Protein degradation DNase Apoptosis FasL TNF TRADD FADD Cas8 Cell death Nature,2009,457,1019-1022

  13. Johnstone RW, et al. Nature Cancer, 2008, 8, 782-798

  14. Caspase家族成员特性一览表 注：W为色氨酸，E谷氨酸、H为组氨酸、D为天冬氨酸、I为异亮氨酸、L为亮氨酸、V为缬氨酸、X为任何氨基酸 （by Thonberry, 1997)

  15. Caspase活化的三种方式

  16. Caspase的活化

  17. Caspase-independent signaling pathways

  18. Mitochondrial Control of Apoptosis

  19. 细胞凋亡的基因调控 Bcl-2家族 Bc1-2是一种原癌基因，是ced-9在哺乳类中的同源物。和一般的癌基因不同，Bc1-2延长细胞的生存，能抑制细胞凋亡,而不是促进细胞的增殖。Bcl-2家族已发现15个成员，所有Bcl-2家族成员均含有1个或多个BH结构域。蛋白含有4个Bcl-2同源结构域，依次命 名为BHl、BH2、BH3和BH4。

  20. Bcl-2亚家族： Bcl-2 Bcl-xl Bcl-w、Mcl-1、A1。 Bcl-2亚家族成员对细胞凋亡起抑制作用 Bax亚家族：Bax、Bak、Bok，它们的作用与Bcl-2亚家族的作用相反，可促进细胞凋亡。 BH3亚家族：Bik、Blk、Hrk、BNIP3、Biml、Bad、Bid；仅有BH3结构域。它们的作用也与Bcl-2亚家族的作用相反，可促进细胞凋亡。 作用机制：影响APAF1的功能 影响线粒体的结构与功能

  21. Nature, 2008,8,121-132

  22. P53与细胞凋亡 P53是肿瘤抑制基因，其产物主要存在于细胞核内。P53基因是人类肿瘤有关基因中突变频率最高的基因。在依赖P53蛋白的细胞凋亡中，P53基因是通过调节Bc1-2和Bax基因的表达来影响细胞凋亡的。P53蛋白能特异地抑制Bc1-2的表达，相反对Bax的表达则有明显的促进作用。研究表明，P53蛋白是Bax基因的直接的转录活化因子。在这些细胞中，P53蛋白的积累和活动引起了细胞凋亡。

  23. Apoptosis Assays

  24. 细胞凋亡诱导剂 • 化学诱导剂 • H2O2 • 化疗药物 • 物理性因子 • 放射线 • UV • 生物因子 • Anti-Fas TNF Trail

  25. 细胞凋亡的形态学变化

  26. 细胞凋亡的形态学检测方法 • 光学显微镜 • 荧光显微镜 (Hoechst 33342，Hoechst 33258, DAPI ) • 电子显微镜

  27. 光学显微镜观察

  28. 荧光显微镜观察

  29. 电子显微镜观察

  30. 细胞凋亡的生物化学检测方法 • 磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法） • TUNEL法 • DNA片断化检测 • DNA Ladder 测定 • DNA含量分析

  31. 磷脂酰丝氨酸外翻分析（Annexin V法）

  32. 不同凋亡阶段的区分

  33. 流式细胞仪分析（FACS）

  34. 流式细胞仪定量分析细胞凋亡

  35. 荧光显微镜定性观察细胞凋亡

  36. TUNEL法 • 细胞凋亡中, 染色体DNA双链断裂或单链断裂而产生大量的粘性3'-OH末端，可在脱氧核糖核苷酸末端转移酶（TdT）的作用下，将脱氧核糖核苷酸和荧光素、过氧化物酶、碱性磷酸酶或生物素形成的衍生物标记到DNA的3'-末端，从而可进行凋亡细胞的检测，这类方法称为脱氧核糖核苷酸末端转移酶介导的缺口末端标记法（terminal -deoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling, TUNEL）。

  37. TUNEL法 检测原理： 凋亡产生的断裂的DNA-----TdT酶标记dUTP-Biotin-----结合链霉亲和素-HRP-----作用于底物DAB显色

  38. 冰冻组织切片 石蜡包埋组织切片 固 定 脱 蜡 水 合 样本通透性的促进(蛋白酶K或Triton-100处理) TdT酶作用下Biotin-dUTP与样本DNA的标记反应 加入Streptavidin-HRP及底物DAB的显色反应 光学显微镜观察 Tunel 原位凋亡检测试剂盒 细胞涂片、贴壁细胞爬片 • 检测方法

  39. Tunel 原位凋亡检测试剂盒 • 检测结果

  40. DNA Ladder 试剂盒 • 检测原理 • DNA片段化 激活核酸内切酶 核小体连接区发生DNA降解， 寡核小体片段（160～200bp的倍数) • 检测材料与方法 细胞或新鲜组织，裂解——蛋白酶和RNA酶消化——提取DNA片段——琼脂糖电泳 • 检测结果: 琼脂糖电泳图片

  41. DNA片断化检测 • DNA Ladder

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