1 / 32

PRO-APOPTOTSKI I ANTI-APOPTOTSKI ČIMBENICI U RANOM RAZVOJU ZUBA U ČOVJEKA

PRO-APOPTOTSKI I ANTI-APOPTOTSKI ČIMBENICI U RANOM RAZVOJU ZUBA U ČOVJEKA. Javna rasprava o temi doktorske disertacije Pristupnica: Danijela Kalibović Govorko , dr.med.dent. Mentorica: prof.dr.sc. Mirna Saraga-Babić, dr.med .

matt
Download Presentation

PRO-APOPTOTSKI I ANTI-APOPTOTSKI ČIMBENICI U RANOM RAZVOJU ZUBA U ČOVJEKA

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. PRO-APOPTOTSKI I ANTI-APOPTOTSKI ČIMBENICI U RANOM RAZVOJU ZUBA U ČOVJEKA Javna rasprava o temi doktorske disertacije Pristupnica: Danijela KalibovićGovorko, dr.med.dent. Mentorica: prof.dr.sc. Mirna Saraga-Babić, dr.med. Zavod za anatomiju, histologiju i embriologiju, Sveučilište u Splitu, Medicinski fakultet, studij Dentalne medicine Split, 15. rujna, 2010.g.

  2. SADRŽAJ PREZENTACIJE • uvod • problematika i cilj istraživanja • hipoteza • metode istraživanja • rezultati pilot studije • znanstveni doprinos

  3. UVOD PREUZETO IZ: ThesleffI, Nieminen P.Tooth morphogenesis and cell differentiation. Curr Opin Cell Biol, 1996. 8(6): p. 844-50.

  4. Hertwig-ova korjenska ovojnica Ektoderm prvog ždrijelnog luka Oblik korijena Vratna petlja Caklinski organ Vanjski caklinski epitel Zubna osnova Caklinska mrežica Primarni epitelni pričvrstak Reducirani zubni epitel Intermedijarni (središnji) sloj Ameloblasti Caklina Unutrašnji caklinski epitel Caklinski čvorić Uzorak krune Odontoblasti Dentin Zubna papila Nediferencirane mezenhimne stanice Fibroblasti Pulpa Ektomezenhimneuralnog grebena Cement Zubni vrećica (folikul) Cementoblasti Parodontni ligament Fibroblasti Osteoblasti Alveolarna kost

  5. CAKLINSKI ČVORIĆ • Nakupina stanica u sredini unutarnjeg caklinskog epitela • Proizvodi niz signalnih molekula (FGF, BMP, Shh, Wnt) koje utječu na rast epitela i ektomezenhima, oblikovanje zuba, prostorni raspored, broj i oblik kvržica • Primarni caklinski čvorić nastaje na vršku zubnog pupoljka, a odstranjuje se apoptozom • Sekundarni caklinski čvorići nastaju na vrhovima budućih kvržica molara te reguliraju njihov položaj i oblik

  6. Caklinski čvorić PREUZETO IZ: Koyama, E., et al., Polarizing activity, Sonic hedgehog, and tooth development in embryonic and postnatal mouse. Dev Dyn, 1996. 206(1): p. 59-72. Vaahtokari, A., et al., The enamel knot as a signaling center in the developing mouse tooth. Mech Dev, 1996. 54(1): p. 39-43.

  7. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA • Nedostatak istraživanja o ranim stadijima razvoja zuba u čovjeka • Istraživanja na pokusnim životinjama pokazala su značajne razlike u prostorno-vremenskom izražaju proliferacijskih, pro-apoptotskih i anti-apoptotskih čimbenika tijekom razvoja zuba

  8. PROBLEMATIKA ISTRAŽIVANJA • Poremećaji proliferacije, apoptoze i diferencijacije tijekom razvoja zuba i čeljusti dovode do pojave raznih patoloških promjena (često u sklopu sindroma): • Anomalije oblika, broja, veličine, građe, vremena nicanja i položaja zuba u čeljusti • Razvojnih cista i tumora

  9. CILJEVI ISTRAŽIVANJA Ki-67 Kaspaza-3 Bcl-2 Sindekan-1 Bax Hsp-70 p53

  10. Stanica Ki-67 p53 Sindekan-1 Bax Bcl-2 Hsp 70 Kaspaza-3 Preživljenje Stanična smrt Stanična specijalizacija

  11. CILJEVI ISTRAŽIVANJA • Istražiti pojavu, raspodjelu i promjenu proliferacijske aktivnosti stanica primjenom Ki-67 biljega tijekom različitih stadija ranog razvoja zuba • Istražiti prisustvo, prostorni i vremenski slijed pojavljivanja pro-apoptotskih čimbenika kaspaze-3 i p53 u različitim dijelovima zuba tijekom razvoja

  12. CILJEVI ISTRAŽIVANJA • Utvrditi prostorni i vremenski slijed pojavljivanja anti-apoptotske bjelančevine Bcl-2, sindekana-1 i Hsp-70 kao mogućih poticatelja proliferacije i diferencijacije • Dvostrukim bojenjem dokazati moguću istovremenu prisutnost različitih čimbenika u istoj stanici: • Bax i Bcl-2 • Ki-67 i sindekan-1 • Ki-67 i Bcl-2

  13. HIPOTEZA • Imunohistokemijsko istraživanje ranih faza u razvoju ljudskog zuba ukazati će na moguću ulogu istraživanih čimbenika u normalnom razvoju i diferencijaciji specifičnih dijelova zuba

  14. HIPOTEZA • Promjene u izražaju i prostornom rasporedu svih navedenih čimbenika analizirat će se tijekom ranog razvoja zuba (5.-10. tjedan): • Ki-67 biljeg očekujemo u svim dijelovima zuba, očekuje se promjena u njegovoj zastupljenosti i prostornom rasporedu paralelno s rastom i diferencijacijom zuba • Pojava Bcl-2 biljega očekuje se u epitelnoj osnovi zubnog pupoljka i nešto slabiji izražaj u okolnom mezenhimu

  15. HIPOTEZA • U ranijim razvojnim fazama zuba očekuje se manja uloga kaspaze-3 i veća uloga p53 apoptotskog čimbenika • Porast izražaja Hsp-70 očekuje se tijekom ranog razvoja i diferencijacije zuba i nešto manji izražaj u okolnom ektomezenhimu • Pojavu sindekana-1 očekujemo u specifičnim područjima osnove zuba te naročito u pripadajućem zubnom ektomezenhimu tijekom kasnijih razvojnih faza

  16. HIPOTEZA • Interakcije istraživanih čimbenika mijenjati će se tijekom razvoja zuba te omogućavati rast i diferencijaciju zubne osnove i razvoj specifičnih staničnih linija: • Prevladavanje proliferacijskih i anti-apoptotskih čimbenika u ranijim razdobljima • U kasnijim razdobljima oblikovanja osnove zuba, veći izražaj apoptotskih čimbenika i čimbenika diferencijacije

  17. METODE ISTRAŽIVANJA • Sakupljanje tkiva i određivanje starosti zametaka • Tkivo normalnih ljudski zametaka starosti 5-10 tjedana (iz postojeće arhivske zbirke Zavoda za anatomiju, histologiju i embriologiju te tkivo sakupljeno u Kliničkom zavodu za patologiju, sudsku medicinu i citologiju KBC Split, a uz suglasnost Etičkog povjerenstva za biomedicinska istraživanja MF u Splitu) • Kriteriji očuvanosti tkiva: bez vanjskih znakova maceracije, promjene boje i anomalija • Određivanje starosti: na temelju podataka o ovulacijskoj dobi, mjerenjem (CRL) te uspoređivanjem sa stadijima Carnegie instituta

  18. METODE ISTRAŽIVANJA • Vođenje, uklapanje i rezanje tkiva: • Mikrosekcija (odvajanje tkiva koje sadrži zubne zametke) • Fiksacija u 4% formaldehidu, ispiranje u PBS-u, dehidracija, ksilol, uklapanje u parafinu • Rezanje na sagitalne, frontalne ili transverzalne rezove debljine 5-7 µm • Lijepljenje na predmetna stakla, orijentacijsko bojenje svakog desetog stakla H&E (razina reza, očuvanost tkiva)

  19. METODE ISTRAŽIVANJA • Imunohistokemijsko bojanje rezova • Primarna protutijela: • Ki-67 • Bax • Bcl-2 • p53 • kaspaza-3 • sindekan-1 • Hsp-70 • Sekundarna detekcija primarnih protutijela: • Bojanje DAB-om • Imunofluorescencija (TRITC i FITC)

  20. METODE ISTRAŽIVANJA • Kvantifikacijska analiza Ki-67, sindekan-1 i Hsp-70 pozitivnih stanica i statistički postupci: • Brojenje pozitivnih stanica (smeđe obojenje stanice DAB-om) i računanje njihovog udjela u ukupnom broju stanica • Određivanje moguće statistički značajne razlike u postotku pozitivnih stanica: • Među razvojnim tjednima • Među različitim dijelovima zuba • Mann-Whitney test: neparametrijski test za dva nezavisna uzorka (dolaze li dva nezavisna uzorka iz iste distribucije) • Kruskal-Wallis test: neparametrijski, proširenje MW testa za tri i više grupa • Razina značajnosti je 0.05

  21. METODE ISTRAŽIVANJA • Semi-kvantifikacijska analiza: određivanja intenziteta i prostorne raspodjele pojedinih čimbenika u raznim dijelovima zubne osnove tijekom razvoja (označeno kao odsustvo, slaba ili jaka izraženost) • Kolokalizacijska analiza: određivanje prisustva dvaju čimbenika u istoj stanici primjenom dvostruke imunofluorescencije te određivanje stanica koje pokazuju dvostruki izražaj

  22. REZULTATI PILOT STUDIJE • Imunohistokemijsko bojenje DAB-om • Ki-67 • Bcl-2 • kaspaza-3 • p53 • sindekan-1 • Hsp-70 • Imunofluorescentno bojenje (dvostruko bojenje) • Bax i Bcl-2 • Ki-67 i Bcl-2 • sindekan-1 i Hsp-70

  23. REZULTATI PILOT STUDIJE • Kalibović Govorko D, Bečić T, Vukojević K, Mardesic-Brakus S, Biočina-Lukenda D, Saraga-Babić M, Spatial and temporal distribution of Ki-67 proliferation marker, Bcl-2 and Bax proteinsin the developing human tooth. Arch Oral Biol (2010) • Mardešić-Brakus S, Kalibović Govorko D, Vukojević K, Alujević Jakus I, Carev D, Petričević J, Saraga-Babić M, Apoptotic and antiapoptotic factors in early human mandible development. Eur J Oral Sci (2010)

  24. Ki-67

  25. Bcl-2

  26. Bcl-2 Ki-67 merge Bcl-2 Bax merge

  27. KASPAZA- 3 p53 Hsp70 Sindekan-1

  28. Syndecan-1/Hsp-70 merge

  29. ZNANSTVENI DOPRINOS • Dobivanje novih saznanja o ranom razvoju zuba u čovjeka o kojima ne postoje literaturni podaci te o raspodjeli, vremenu i mjestu pojavljivanja pojedinih razvojnih čimbenika • Određivanje % pozitivnih stanica za pojedini istraženi čimbenik (tijekom 5.-10. razvojnog tjedna) ukazat će na slijed razvojnih zbivanja koji su uvjet normalnog razvoja zuba • Pokazati će se da je fina regulacija izražaja genskih proizvoda u stanicama osnove budućeg zuba ključna za normalni razvoj zuba

  30. ZNANSTVENI DOPRINOS • Istraživanje procesa normalnog oblikovanja i diferencijacije zuba i susjednih struktura od velike je važnosti za razumijevanje nastanka razvojnih anomalija, cista i tumora • Poremećaji stanične proliferacije, diferencijacije i apoptoze, odnosno perzistencije embrionalnih tvorbi dovode do patoloških promjena

  31. ZNANSTVENI DOPRINOS • Istraživanje mehanizama nastanka patoloških promjena ima kliničku primjenu u području dentalne medicine: • Oralna kirurgija: razvojne ciste i tumori • Ortodoncija: anomalije broja, oblika, položaja zuba i čeljusti (od preko 5000 poznatih genetskih sindroma, u više od 700 postoje dentalne/oralne/kranio-facijalne anomalije)

  32. HVALA NA PAŽNJI Hvala djelatnicima Zavoda za anatomiju, histologiju i embriologiju studija Medicina i Dentalna medicina Medicinskog fakulteta Sveučilišta u Splitu

More Related