300 likes | 889 Views
Danica Matišić. KVALITATIVNO I KVANTITATIVNO ODREĐIVANJE MONOKLONSKOG PROTEINA U MM I SRODNIM POREMEĆAJIMA – kako koristiti metode i interpretirati nalaze. DIJAGNOZA MULTIPLOG MIJELOMA OSNIVA SE NA NALAZU KLASIČNOG TRIJASA:. NALAZU MONOKLONSKOG IMUNOGLOBULINA U SERUMU I/ILI URINU
E N D
Danica Matišić KVALITATIVNO I KVANTITATIVNO ODREĐIVANJE MONOKLONSKOG PROTEINA U MM I SRODNIM POREMEĆAJIMA – kako koristiti metode i interpretirati nalaze
DIJAGNOZA MULTIPLOG MIJELOMA OSNIVA SE NA NALAZU KLASIČNOG TRIJASA: • NALAZU MONOKLONSKOG IMUNOGLOBULINA U SERUMU I/ILI URINU • INFILTRACIJE KOŠTANE SRŽI PLAZMA STANICAMA (>10%) • OSTEOLITIČKIH ŽARIŠTA IMUNOKEMIJSKU METODU ZA ODREĐIVANJE RAZREDA I TIPA MONOKLONSKOG IMUNOGLOBULINA, PRVI PUT OPISALI SU GRABAR I WILLIAMS 1953.GOD.
LABORATORIJSKA EVALUACIJA MONOKLONSKOG PROTEINA Robert A, Kyle, David F. Keren,Raymond Alexanian,Usha Kallemuchikkal 1. Elektroforeza proteina u serumu i urinu: • nisko rezolutne elektroforeze • visoko rezolutne elektroforeze 2. Kvantitativno određivanje imunoglobulina • Nefelometrijski ili turbidimetrijski • Radijalna imunodifuzija 3. Definiranje razreda i tipa monoklonskog imunoglobulina • Imunofiksacija • Imunoelektroforeza • Imunoselekcija • Imunosupstrakcija: moguća samo uz kapilarnu elektroforezu 4. Kvantitativno određivanje monoklonske komponente • Denzitometrijski 5. Kontrola kvalitete evaluacije monoklonskog proteina Ključna komponenta interne kontrole: direktan kontakt biokemičara s kliničarem o slučaju koji je neuobičajene prirode ili ako postoji bilo koja diskrepansa u nalazu
Elektroforeza serumskih proteina Vizualni pregled Klinička sumnja ili prisutnost monoklonske vrpce Bez promjena Elektroforeza serum. prot. Bence Jones protein? Imunofiksacija i/ili imunoelektroforeza Proteinogram Elektroforeza proteina u mokraći (100 x ukonc. uzorak) Definicija M-P (određ. razreda i tipa) Denzitometrijska kvantifikacija M-P Negativ. nalaz Prisutan BJ protein Imunofiksacija Imunofiksacija i/iliimunoelektroforeza Opisni nalaz + klinička informacija daju tumačenje nalaza Imunoelektroforeza NACIONALNA GRUPA ZA LIJEČENJE HEMATOLOŠKIH BOLESTI Pododbor za laboratorijsku hematologiju i morfologiju IMUNOKEMIJA: D. Matišić, V. Preden-Kereković DIJAGNOSTIČKI ALGORITAM ZA DEFINICIJU MONOKLONSKOG PROTEINA (M-P)
Elektroforeza serumskih proteina može se izvesti nisko i visoko rezolucijskim tehnikama: 1. Elektroforeza proteina u serumu i mokraći indicirana je za svakog bolesnika kod kojeg postoji sumnja na poremećaj plazma stanica. Nisko rezolucijske elektroforeze:elektroforeza na acetat-celulozi ili agarozi: razdvaja proteine na pet frakcija. Kod ove tehnike nije moguće postići dobro razdvajanje β1-(transferin) i β2-globulinske frakcije (C3) Visoko rezolucijske elektroforeze:kapilarna zonska elektroforeza omogućuje bolje razdvajanje transferina i C3 u području kao i bolje uočavanje niskih koncentracija M-proteina koji mogu putovati od 2 do gama područja
NISKO REZOLUCIJSKA ELEKTROFOREZA SERUMSKIH PROTEINA 1.Procjena približne koncentracije glavnih serumskih proteina: alb, alfa-1-AT,Hp, alfa-2-M, C3, Tf, IgA i IgG 2.Detekcija monoklonskog proteina 3.Osjetljivost detekcije monoklonskog proteina je 2 g/L na acetat-celulozi i 1 g/L na agarozi
VISOKO REZOLUCIJSKA ELEKTROFOREZA SERUMSKIH PROTEINA – KAPILARNA ZONSKA ELEKTROFOREZA + -- - Visoki stupanj rezolucije posljedica je više faktora: • primjena visokih napona (od 3-30 kV) • kontrola temperature • kontrola debljine sloja gela i • sama aplikacija uzorka
Visoko rezolucijski sustavi omogućuju razdvajanje proteina na 10 do 12 frakcija: prealbumin, albumin, -lipoprotein, α1-kiseli glikoprotein (orozomukoid), α1-antitripsin, α2- makroglobulin, haptoglobin, transferin, -lipoprotein, C3, fibrinogen, CRP (kad je značajno povišen) i -globulini koje uglavnom predstavlja IgG.
Primjer CZE Figure 1. Electropherograms of a sample with an IgM monoclonal protein. (A), agarose electrophoresis (Hydragel 15 HR) on the Hydrasys system (Sebia); (B), capillary zone electrophoresis (Paragon 2000; Beckman-Coulter); (C), agarose electrophoresis (Hydragel 15 HR) on the Hydrasys system (Sebia) after mercaptoethanol treatment (10 µL of 1:10 dilution of mercaptoethanol added to 100 µL of serum). The fractions in panels A and C are albumin, 1-antitrypsin, -lipoprotein, 2-macroglobulin and haptoglobin, ß-lipoprotein, transferrin, C3, and the -globulin fraction. The small deflectionin the mid-gamma region is an artifact. The arrow indicates the monoclonal protein.
Vizualni pregled elektroforeze Klinička sumnja ili prisutnost monoklonske vrpce Bez promjena Hp-Hb CRP Hb Opisni nalaz + klinička informacija daju tumačenje nalaza Imunoelektroforeza i/ili imunofiksacija ili imunosupstrakcija
2.Za definiranje razreda i tipa M-proteina indicirana je imunoelektroforeza i/ili imunofiksacija ili imunosupstrakcija koja je moguća samo uz kapilarnu zonsku elektroforezu anoda + katoda - Heidelberger-Kendallova krivulja
-iako je nalaz elektroforeze negativan kod suspektnih bolesnika treba naparaviti IF (IgD, IgE)) -imunofiksacija nije indicirana ako se ustvrdi poliklonska hipergamaglobulinemija IMUNOELEKTROFOREZA IMUNOFIKSACIJA
Imunoselekcija je imunokemijska tehnika kojom se mogu dokazati monoklonski sintetizirani teški lanci. • U gelu agara, u koji su prethodno dodani antiserumi na vezane lake lance kapa i lambda tipa, elektroforetski se razdvoje proteini u serumu. Pri tom razdvajanju, dolazi do vezanja kompletnih molekula imunoglobulina, dok eventualno prisutni monoklonski slobodni teški lanci ostaju nevezani. • U slijedećem koraku izvodi se imunokemijska reakcija precipitacije slobodnih teških lanaca sa specifičnim antiserumom na γ (G), α (A) ili μ (M)teške lance.
3.M-protein je potrebno pratiti denzitometrijski ali IF nije potrebno ponavljati ako se nisudogodile promjene u migraciji M-proteina ili ako se nije pojavila nova vrpca 2. Nefelometrijski izmjereni Ig: G = 26,3 g/L A = 0,43 g/l M = 0,35g/L Denzitometrijski izmjereni: IgG = 29,4 g/L κ=8,16g/L λ=0,57g/L κ/λ=14,3 (κ=1,7-3,7; λ= 0,90-2,10 κ/λ= 1,35-2,65) 1 1 1 2 3 Alb M-prot. 2 3 2. Nefelometrijski izmjereni Ig: G = 4,6 g/L A = 14,9 g/L M = 0,62 g/L Denzitometrijski izmjereni IgA = 19,1 g/L
4. Za sve bolesnike s poremećajem plazma stanica potrebno je nefelometrijsko ili turbidimetrijsko određivanje Ig da bi se ustvrdila koncentracija ostalih neuključenih Ig Nefelometrijski određeni Ig: G=3,70 g/L A=43,4 g/L M=0,16g/L Denzitometrijski određen: IgA=36,7g/L 4 4.Nefelometrijski izmjereni Ig: G = 22,74 g/L A = 0,14 g/l M = 0,10 g/L Denzitometrijski izmjer. G = 21,4 g/L 4
5.Kod bolesnika s multiplim mijelomom, Waldenström makroglobulinemijom i amiloidozom potrebno je pratitipromjene u koncentraciji M-proteina svakih 1-2 mj.;dok je kod MGNZdovoljno je:1x u godini G = 16,3 g/L G = 26,3 g/L G = 12,3 g/L
6. Hiperviskozni sindrom traži zamjenu plazme s indikacijama utemeljenim na kliničkim značajkama(viskozitet i elektroforezu seruma treba napraviti prije nego se plazma zamijeni,radi usporedbe koncentracija M-proteina)Primjer elektroforeze bolesnika sWaldenström m.prije (A) i poslije (B) plazmafereze: A B
7.Krioglobuline treba napraviti u svih bolesnika s M-proteinom koji pokazuju osjetljivost na hladnoću, posebno kod onih sa M-IgM.
ključna komponenta interne laboratorijske kontrole je izravan kontakt biokemičarai kliničara o slučaju koji je neuobičajene prirode ili ako postoji bilo kakav nesklad u nalazu. 8. Kontrola kvalitete laboratorijske evaluacije M-proteina:
Bence-Jones protein 9. Svim bolesnicima s multiplim mijelomom, Waldenström makroglobulinemijom, amiloidozom i srodnim bolestima potrebno je odrediti prisutnost i dnevno izlučivanje BJP (IF:najmanje 100x ukoncentriranog urina) Monoklonski slobodni lagani lanci imunoglobulina, Bence-Jones proteini, (BJP),suhomogenapopulacija,kapa (κ) ililambda (λ) tipa, lakihlanacaimunoglobulinakojestvaramaligniklonB-stanica.
Bence-Jones protein Elektroforeza proteina u mokraći (najmanje 100x ukonc. uzorak) Prisutan protein BJ Negativ.nalaz: ako na elektroforetskoj slici 100x ugušćenog urina ne nalazimo nikakvu suspektnu monoklonsku vrpcu Preporuka je: koristiti 24 satni urin
Identifikacija BJP imunofiksacijom ili imunoelektroforezom Elf.prot. u serumu Elf.prot. u urinu IE
Serum Free Light Chain Assay in Diagnosis and Monitoring of Multiple Myeloma D.E. Smith, A.R. Bradwell, G.P. Mead, H.D. Carr-Smith Article Archives: 2005, Volume 16, Number 1 Introduction A distinguishing feature of the monoclonal gammopathies is the production of homogeneous populations of immunoglobulins by malignant clones of B-cells. Production of free light chains (FLCs) is an important feature of light chain diseases, such as light-chain myeloma (LCMM), primary systemic (AL) amyloidosis, and light-chain deposition disease (LCDD). However, in a retrospective study of 745 archived samples from patients with plasma cell disorders, 91% had abnormal FLC levels, and 97% had either elevated FLC levels or an abnormal ratio (see Table 1)[1-3]. Among those patients with intact immunoglobulin myeloma, 96% were found to have either elevated FLC levels or an abnormal ratio. Referentni intervali za slobodne lake lance u serumu:
B: koncentracija lakih lanaca u serumu kod zdravihispitanika,bolesnika saNSMM i MMLL kapa i lambda tipa A B Osjetljivost SPE Osjetljivost IF A: koncentracija lakih lanaca u serumu kod zdravihispitanika,bubrežnih bolesnika i bolesnika sa MMLL kapa i lambda tipa
Kristali Bence-Jones proteinaRazumijevanje strukture kristala BJP moglo bi biti ključno za razvoj selektivne terapije lijekovima. Microgravity Space is the laboratory of the next millennium Mikrogravitacijski uvjeti u svemiru su jedinstveni okoliš za istraživanja koja vode novim produktima i tehnologijama. STS-95 STS-80