COOPERACION ANVISA / AECI

1. COOPERACION ANVISA / AECI VALIDACION DE METODOS CALCULO DE INCERTIDUMBRE DE MEDIDA TORO NOZAL M.J., YSA VALLE M. CENTRO DE INVESTIGACION Y CONTROL DE LA CALIDAD (C.I.C.C.) - INSTITUTO NACIONAL DEL CONSUMO MINISTERIO DE SANIDAD Y CONSUMO

2. VALIDACIÓN DE MÉTODOS ISO/IEC 17025:1999 (5.4.5.1) Confirmación mediante examen y la aportación de evidencias objetivas que demuestren el cumplimiento de ciertos requisitos para el uso específico previsto

3. ESTIMACIÓN DE LA INCERTIDUMBRE DE MEDIDA ISO/IEC 17025:1999 (5.4.6.2) Los laboratorios de ensayo deben disponer y aplicar procedimientos para estimar la incertidumbre de medida.

4. GENERALIDADES MÉTODOS QUE REQUIEREN ALGÚN TIPO DE VALIDACIÓN MÉTODOS INTERNOS MÉTODOS EXTERNOS

5. MÉTODOS INTERNOS • Los desarrollados en el propio laboratorio. • Deberán ser validados en función del uso que se vaya a hacer de ellos, definiendo su campo de aplicación. • En estos métodos se realizará una nueva validación (parcial o total) cuando se cambien las condiciones del mismo.

6. MÉTODOS EXTERNOS 1 Los desarrollados fuera del laboratorio y publicados por organismos oficiales y/o de reconocido prestigio (CEN, AENOR, etc.).

7. MÉTODOS EXTERNOS 2 No requerirán validación cuando se tiene constancia de que han sido validados y se dispone de los correspondientes parámetros de validación. Es suficiente que el laboratorio se asegure que el uso que pretende hacer del método es compatible con éste (material, ensayo, precisión, etc..).

8. MÉTODOS EXTERNOS 3 Cuando un método externo validado sea modificado para su uso en el laboratorio, se dispondrá de un PNT que recoja las modificaciones y se evaluarán los parámetros necesarios para asegurar su correcta validación.

9. MÉTODOS EXTERNOS 4 Los métodos validados por ensayos interlaboratorios en los que participe el laboratorio se considerarán como métodos externos publicados, si se dispone de los parámetros de validación del mismo.

10. MÉTODOS EXTERNOS 5 • Los métodos externos publicados por organismos oficiales y/o de reconocido prestigio de los que no se tenga constancia de su validación, deberán ser validados antes de ser utilizados en los ensayos.

11. REALIZACIÓN Operaciones previas Modo operativo Parámetros a evaluar Materiales empleados en la validación Validaciones de M. Cuantitativos Métodos semicuantitativos Métodos cualitativos Métodos de identificación

12. Nombramiento del responsable (o responsables) de la validación. Recopilación de la normativa aplicable Elaboración del PNT de ensayo. Definición de las características mínimas del método y de los parámetros analíticos a validar así como los criterios de aceptación, en función de los requisitos. Se Documentará por escrito en el documento de diseño de la validación: La sistemática completa a seguir en el proceso de validación El nº de experimentos necesarios para obtener los valores de los parámetros requeridos Especificar las muestras que se van a emplear (marca, lote, fecha, etc,,), la forma de empleo, como se van a marcar, los M.R. que se van a utilizar, etc. Si se emplean datos históricos, especificar exactamente cuales son y todos los datos que permitan su trazabilidad. Comprobación que los equipos a utilizar estén calibrados y/o veri-ficados y en perfecto estado de funcionamiento Comprobado y Vº. Bº. del R.T. Operaciones previas

13. Modo operativo • Definir la sistemática de experimentos necesarios para obtener los valores de los parámetros requeridos. • Los parámetros a determinar estarán en función del uso del método • Cuantitativo • Semicuantitativo • Cualitativo • Identificativo • La información relativa al proceso de validación será anotada en un registro de validación.

14. Parámetros a evaluar • Linealidad/Función de respuesta • Selectividad/Especificidad • Precisión: • Repetibilidad • Reproducibilidad • Veracidad (Exactitud) • Límite de cuantificación • Límite de detección • Rango o intervalo de trabajo • Incertidumbre

15. Parámetros a evaluar

16. Materiales empleados en la validación • Materiales de Referencia Certificados (MCR) (NIST, LGC, BCR) • Materiales de Referencia (MR) • Muestra analizada por otro método normalizado debidamente evaluado • Muestras con adiciones de sustancia de concentración certificada.

17. MCR • Se verificará que el material de referencia viene acompañado de su certificado, en el que se especifique claramente: • el método por el que se ha certificado el material • el número de participantes en la certificación • su periodo de caducidad y/o condiciones de conservación.

18. MR • Materiales obtenidos a partir de “Test de eficiencia” suministrados por Entidades Organizadoras del mismo, al que se les asigna un valor y una incertidumbre (o variabilidad del valor de referencia). • Llevan asociado un certificado, pero que no incluye todos los requisitos de un MCR. • Se recomienda que el número de laboratorios que participan en la asignación del valor sea superior a 10.

19. MUESTRA ANALIZADA POR OTRO MÉTODO NORMALIZADO DEBIDAMENTE EVALUADO • Según el parámetro de validación, se realizará el estudio mediante la comparación de los resultados por pares de valores de ambos métodos como datos independientes.

20. MUESTRAS CON ADICIONES DE SUSTANCIAS DE CONCENTRACIÓN CERTIFICADA • Muestras preparadas en el laboratorio con muestras de bajo nivel de concentración del analito a las que se añade una cantidad conocida de patrón certificado.

21. Materiales empleados en la validación • Todos los valores de referencia tendrán calculada:su incertidumbre estimada o el intervalo de confianza conocido y compatible con los requisitos especificados. • Los materiales preparados corresponderán a muestras con matriz representativa del alcance que tiene el método que se está validando • Dado que no es posible realizar la validación con materiles de referencia para absolutamente todas las matrices analíticas, se procederá a crear grupos de matrices en los que un material de referencia sea representativo del grupo, para realizar su validación.

22. VALIDACIÓN DE MÉTODOS CUANTITATIVOS • Aquellos en los que tras la aplicación del procedimiento analítico a la muestra analizada, se genera un valor numérico. • Aplicación: • Métodos directos • Métodos que requieren calibración instrumental

23. Criterios reglamentados legales o normativos: se emplearán como criterios de aceptación. Método reglamentado o normativo y se indica el procedimiento de validación: prevalece éste. Muestras de validación: similares a las matrices del campo de aplicación. Tres muestras con valor de referencia conocido para validar a tres niveles. Al no poder validar la totalidad de las matrices, definir familias de matrices en el que el método se pueda decidir que se comporta de igual forma, por evidencias históricas, bibliografía o el sentido común. Aconsejable calcular, y por cada nivel, la cantidad del material a analizar en la validación. Tener en cuenta la caducidad, estabilidad, etc.. Criterios Generales

24. Límites superior e inferior del intervalo en el que se puede determinar el mensurando con aceptable grado de precisión y veracidad. Límite inferior: el más bajo en el que han comprobado precisión y exactitud, a no ser que el método deba medir el nivel más bajo posible o ausencia por lo que será el límite de cuantificación o el de detección. Límite superior: el nivel más alto en el que se ha comprobado la precisión y la veracidad. Criterio de aceptación: Si existe límite legislado: el rango lo incluirá en el intervalo. Si no existe límite legislado: será definido por el uso del método a los requerimientos de los usos del método. Rango o intervalo de trabajo

25. Capacidad de un método para obtener resultados linealmente proporcionales al valor del mensurando en la muestra, dentro de un intervalo determnado. Se determinará mediante la curva de calibración y se comprobará la linealidad analizando diferentes concentraciones de patrones de valor conocido con un mínimo de 5 en el intervalo lineal y al menos cada patrón por duplicado. Criterios de aceptación: Si coef. de variación de los factores de respuesta de las diferentes conc. es inferior al 20%: la recta es lineal y pasa por el origen. Si (Sm/m)x 100 es inferior al 20%, se considera que la recta es lineal. Si el coeficiente de correlación “r” es superior a 0,99 Linealidad

26. Concordancia entre los resultados de ensayos independientes en condiciones estipuladas. El cálculo de la desviación estándar de repetibilidad y de reproducibilidad se empleará el método descrito en la Norma UNE 82009-2, a los datos generados en los ensayos para el proceso de validación. Es recomendable que se realicen un mínimo de 10 análisis en condiciones de reproducibilidad y cada análisis se hará por duplicado, al menos. Repetibilidad Reproducibilidad Precisión

27. Medida de la precisión de un método efectuado en las mismas condiciones. Se expresará como “Límite de repetibilidad” “r”, siendo la diferencia absoluta entre los resultados de dos determinaciones paralelas efectuadas sobre la misma muestra. Para ser aceptados, en condiciones de repetibilidad y con un nivel de significación del 0,05, la diferencia entre los valores de los duplicados no puede ser mayor que el valor de “r”. “r” al 95% de confianza se calcula: r = 2 x x Sr Criterio de Aceptación r Shx2x x F Sh = 0,02 x C0,8495 x 0,67 (C expresado en fracciones másicas) Repetibilidad

28. Medida de la precisión de un método efectuado sobre la misma muestra pero en condiciones diferentes. Se expresará como “Límite de reproducibilidad” “R”, siendo la diferencia absoluta entre los resultados de dos determinaciones realizadas en condiciones de reproducibilidad sobre la misma muestra. “R” al 95% de confianza se calcula: R = 2 x x SR Criterio de Aceptación R SHx2x x F SH = 0,02 x C0,8495(C expresado en fracciones másicas) Reproducibilidad

29. Capacidad de un método analítico para dar resultados lo más próximos posibles al valor verdadero. Las muestras empleadas para la validación de la exactitud, serán preferiblemente MCR. Cada muestras será analizada al menos 10 veces, en condiciones de reproducibilidad intralaboratorio, cada vez por duplicado (20 valores) exactitud/veracidad = x 100 recuperación (%) = x 100 Corrección = VR - Criterio de Aceptación Tabla A.O.A.C. Indice de Compatibilidad 2 Exactitud/Veracidad

30. Selectividad • Grado por el cual un método puede determinar un analito dentro de una mezcla compleja, sin ser interferido por otros componentes de la mezcla. • Las pruebas más utilizadas para determinar la selectividad son, a modo de ejemplo: • Método de adiciones • Comparación de espectros • Comparación de métodos

31. Límite de Cuantificación Menor cantidad de mensurando que puede ser determinada con aceptable precisión y veracidad bajo las condiciones experimentales establecidas.

32. Criterios de Aceptación: Con reglamentación específica: LC < al 50% del valor reglamentado Método normalizado y si se indica el valor del LC, deberá cumplirse con este valor. Métodos con calibración instrumental: Métodos con el análisis de la señal del blanco Sin utilizar la corrección del blanco Cuando se utiliza la corrección del blanco Método estadístico aplicado a la recta de calibrado Regresión sin blanco Regresión con blanco Métodos sin calibración instrumental Límite de Cuantificación

33. Criterios de Aceptación: Con reglamentación específica: LD < al límite reglamentado Método normalizado y si se indica el valor del LD, deberá cumplirse con este valor. Menor cantidad de mensurando que puede ser detectada con aceptable precisión y veracidad bajo las condiciones experimentales establecidas. Deberá ser evaluado solamente en los métodos cualitativos o en los métodos cuantitativos en los que se evalúa la presencia sin proceder a la cuantificación. Límite de Detección

45. MÉTODOS SEMICUANTITATIVOS • El laboratorio sólo debe demostrar exactitud y precisión en un punto. • Este punto de concentración/valor analítico escogido para cada matriz marcará la expresión de resultados que será menor que (<) y mayor que (>). • Generalmente es un límite reglamentado. • Los estudios a realizar son los mismos que pa-ra un método cuantitativo, excepto la linealidad. El L.C. Será inferior al valor validado.

46. MÉTODOS CUALITATIVOS Métodos diseñados para detectar muestras positivas hasta un nivel bajo de presencia del analito • Selectividad • Límite de Detección • Parámetros de calidad de detección del método • Sensibilidad • Especificidad • Falsos positivos • Falsos negativos • Eficiencia

47. MÉTODOS DE IDENTIFICACIÓN Métodos que se pueden tratar como casos particulares de métodos cualitativos, en los que se pretende determinar la identidad de una sustancia o especie pura, por lo que no se requiere el análisis del Límite de Detección, sino pruebas de detección (determinación de falsos negativos, falsos positivos,) El procedimiento de validación estará basado en el epígrafe correspondiente a los métodos cualitativos y serán documentados por los responsables de la validación, definiendo los parámetros a validar.

48. CÁLCULO DE LA INCERTIDUMBRE DE MEDIDA La Norma ISO 17025 establece la necesidad de calcular o estimar las incertidumbres en los resultados de ensayos cuantitativos y calibraciones que se realicen en el laboratorio. Incertidumbre de una Medida Estimación de la parte del resultado completo que caracteriza el intervalo de valores, dentro del cual se encuentra el valor verda-dero de la cantidad medida (o mensurando). Ello, una vez efectua-das las correcciones correspondientes a los errores sistemáticos conocidos. En caso de no corregirse, se incrementará el intervalo de incertidumbre para incluir el efecto del error sistemático.

49. COMPONENTES DE LA INCERTIDUMBRE La incertidumbre de un resultado comprende normalmente mu-chas componentes que pueden ser agrupadas en dos categorías en función del método utilizado para estimar su valor numérico. Tipo A Los que son estimadas aplicando métodos estadísticos a una serie de determinaciones repetidas. Tipo B Las que son estimadas por otros medios. • Estimación basada en la experiencia • Estimadas a partir del conocimiento de los intervalos máximos de variación de una magnitud • Resultados previos • Medidas de las que se conoce su distribución.

50. REALIZACIÓN • Definición de la magnitud a medir • Lista de Causas • Evaluación de los componentes • Cálculo de la estimación de la Incertidumbre Típica Combinada (Uc) • Cálculo de la Incertidumbre Expandida de Medida • Cálculo por etapas