Cytogenetika človeka I

1. Cytogenetika človeka I • zaoberá sa štúdiom chromozómov (ich počtom, morfológiou, segregáciou) za normálnych a patologických podmienok a koreláciou týchto nálezov s fenotypom • chromozómy (ako ich vidíme v mikroskope) predstavujú organizáciu DNA , ktorá sa vyskytuje len krátko, v určitom štádiu bunkového cyklu (v metafáze cyklu M) • majú dôležitú úlohu pri zabezpečovaní správneho a presného rozdelenia genetického materiálu (DNA) do dcérskych buniek počas mitotického a meitického delenia buniek

2. Bunkový cyklus

3. Morfológia chromozómov Chromozómy majú podľa stupňa špiralizácie a kondenzácie v nich uloženej DNA odlišný morfologický vzhľad • interfáza – dešpiralizované dlhé vlákna, pozorovateľné len elektrónovým mikroskopom

4. Morfológia chromozómov – pokr. • metafáza – najvhodnejšia fáza bunkového cyklu na sledovanie chromozómov • chromozómy sú maximálne špiralizované • skladajú sa z 2 chromatíd vzniknutých autoreduplikáciou • primárna konstrikcia (zaškrtenie) • rozdeľuje chromozóm na dve ramená • obsahuje centroméru • sekundárna konstrikcia • v jej oblasti sa nachádza jadierkový organizátor

5. Morfológia ľudských chromozómov

6. Triedenie ľudských chromozómov

7. Morfológia ľudských chromozómov

8. Usporiadanie DNA v chromozóme • nukleozómový reťazec – prvá úroveň špiralizácie • nukleozóm • oktamér histónov H2A, H2B, H3 a H4 • obtočený DNA dĺhej 146 bp (1,75 otáčok) • H1 stabilizuje nukleozóm spacer

9. Usporiadanie DNA v chromozóme – pokr. lešenie

10. Elektrón mikroskopový obraz chromatínu a nukleozómovej reťaze chromatínové vlákno nukleozómový reťazec

11. Elektrón mikroskopový obraz chromozómového lešenia

12. Elektrón mikroskopový obraz rôznych štádií kondenzácie DNA

13. Elektrónový mikroskopový obraz chromozómov

14. Ultraštruktúra chromozómov –pokr. Podľa intenzity sfarbenia, stupňa kondenzácie a intenzity transkripcie sa chromatín delí: • euchromatín • dekondenzovaný v interfáze • slabo sa farbiaci bázickými farbivami • DNA je skoro syntetizovaná v S fáze • geneticky aktívny (obsahuje exprimované gény) • heterochromatín • kondenzovaný aj v interfáze • silne sa farbiaci • DNA syntetizovaná neskoršie v S fáze • geneticky neaktívny

15. Ultraštruktúra chromozómov – pokr. heterochromatín sa delí na: • konštitutívny heterochromatín • pretrváva v kondenzovanom stave počas celého bunkového cyklu vo všetkých bunkách a vo všetkých vývinových štádiách organizmu • nachádza sa predovšetkým v centromérach a často v telomérach • v interfáze vytvára zhluky označnené ako chromocentrá • fakultatívny heterochromatín • v niektorých štádiách ontogenézy alebo v niektorých typoch buniek sú euchromatínového char. v iných heterochromatínového • napr. obsahujú gény, aktívne len v určitých štádiách ontogenézy, alebo chromatín jedného X chr. u žien

16. Počet chromozómov • počet, tvar a veľkosť chromozómov sú stále a druhovo špecifické znaky • počet chromozómov človeka: • 46 (23 párov) – diploidný (v somatických bunkách) • 23 – haploidný (v gamétach) • bol presne stanovený až v roku 1956 (Tjio a Levan) • z toho 22 párov autozómov a 1 pár gonozómov (XX/XY) • karyotyp – súbor chromozómov v somatickej bunke • zápis: 46,XX – ženský, 46,XY – mužský) • označenie karyotyp sa používa aj na obraz metafázických chromozómovusporiadaných podľa štandardnej klasifikácie • idiogram – schematické (idealizované) znázornenie karyotypu

17. Normálny karyotyp muža

18. Normálny karyotyp ženy

19. Idiogram

20. Počet chromozómov – pokr. • počet chromozómov nie je v žiadnom vzťahu s komplexnosťou organizmu alebo fylogenetickým postavením druhu

21. Chromozómová analýza Najvhodnejším štádiom chr. a. je metafáza resp. prometafáza • získať dostatočný počet metafazických buniek je možné len kultiváciou v tkanivových kultúrach • najčastejšie používané bunky – leukocyty, fibroblasty, kostná dreň, bunky plodovej vody • fytohemaglutinín – stimuluje bunkové delenie • kolchicín – zablokuje mitózu v metafáze (inhibuje deliace vretienko) • hypotonizácia – zabezpečí vhodné prietorové rozloženie • fixácia na podložnom sklíčku • farbenie – sú známe rôzne techniky, umožňujúce individuálnu identifikáciu jednotlivých chromozómov s rôznou rozlišovacou schopnosťou

22. Schéma cytogenetickej analýzy

23. Mikroskopický pohľad na metafazické chromozómy

24. Konvenčné farbenie chromozómov

25. C-prúžky

26. G-prúžkovanie(R-prúžkovanie, opačný obraz)

27. SCE – výmena seterských chromatíd

28. FISH – fluorescenčná in situ hybridizácia • kombinácia klasickej a molekulárnej cytogenetiky

29. Dôkaz translokácie pomocou FISH

30. Multifarebná FISH

31. Komparatívna genómová hybridizácia - CGH

32. Komparatívna genómová hybridizácia - CGH

33. Prietoková cytometria (flow cytometry) • umožňuje rýchle a presné meranie množstva DNA

34. Analýza interfázových chromozómov X-chromatín (Barrovo teliesko)

35. Y-chromatín

36. FISH na interfázovom jadre chromozóm č.13 chromozóm č. 21

37. Chromozómová determinácia pohlavia • 22 párov autozómov • 1 pár gonozómov (pohlavných chromozómov) • chromozómové pohlavie typu „drozofila“ • homogametické pohlavie(46,XX) – ženské • heterogametické pohlavie (46,XY) – mužské • chromozómové pohlavie jedinca je určené v momente oplodnenia (k fenotypovému pohlaviu ale vedie ešte dlhá cesta) • všetky vajíčka môžu mať iba X chromozóm • spermie môžu mať X rep. Y chromozóm (pomer 1 : 1) • teoretický pomer počatí jedinca ženského alebo mužského pohlavia je 1 : 1, pri narodení to je 1 : 1,06

38. Chromozómová determinácia pohlavia - pokr.

39. Pohlavné chromozómy a diferenciácia pohlavnej sústavy • rozhodujúce je prítomnosť Y a nie počet X chromozómu • TDF (Testes Determining Factor) na Y chr. spúšťa premenu indiferentných embryonálnych gonád na semenníky • v neprítomnosti TDF vývin pokračuje smerom ženských vnútorných pohlavných orgánov • sekundárne pohlavné znaky sú pod kontrolou hormónov vnútorných pohlavných orgánov • ženský fenotyp – 45,X0, 47,XXX, • mužský fenotyp – 47,XXY, 48,XXXY, 47,XYY ... • chromozómové pohlavie sa nemusí zhodovať s fenotypovým pohlavím (mutácie v génoch zapojených do diferenciácie pohlavia)

40. „Kompenzácia dávky“ (hypotéza Lyonovej) • X chr. je nosičom génov ako hociktorý autozóm • Y chr. obsahuje veľmi málo génov a sú odlišné od génov na X (okrem pseudoautozomálnej oblast na konci krátkych ramien) • ženy majú dvojnásobné množstvo X-viazaných génov • dvojnásobná dávka produktov – v skutočnosti neplatí Hypotéza Lyonovej – kompenzácia dávky inaktiváciou jedného z dvoch X chr. u ženy • uskutočňuje sa vo včasnom štádiu blastogenézy (okolo 12. dňa • je náhodná (v niektorých bunkách sa inaktivuje X maternálneho v iných paternálneho pôvodu) • ale je fixovaná vo všetkých následných generáciách buniek danej línie

41. Hypotéza Lyonovej – pokr. • ženský organizmus predstavuje mozaiku • inaktívny X chr. v interfáze tvorí X-chromatín (Barrovo teliesko) • počet Barrových teliesok sa rovná počtu X chr. mínus 1 45,XO = O, 46XY = 0, 46,XX = 1, 47,XXX = 2, 47,XXY = 1 • replikácia DNA v ňom prebieha neskôr • je geneticky takmer inertný (niektoré gény ale sú exprimované) • inaktivácia nie je úplná • osoby s odchýlkou od normálneho počtu X chr. klinicky nie sú úplne zdravé • napr. 45,X0 – Turnerov syndróm • 47,XXY – Klinefelterov syndróm, a pod.

42. Prejav X chr. mozaicizmu Čierne a oranžové škvrny sú zapríčinené rozdielnými alelami v tom istom lokuse na X chr. Kaliko mačka je heterozygotná pre tieto alely a je vždy samička.

43. Evolúcia chromozómov Definície • ortológia – homologické chromozómy/úseky u rôznych druhov • paralógia - homologické úseky/gény v rámci druhu na rôznych chromozómových lokalizáciách • synténia – lokusy na tom istom chromozóme (nemusia byť vo väzbe, keď sú dostatočne ďaleko od seba) Typy chromozómových zmien v evolúcii frekventné prestavby veľkého rozsahu, aj medzi príbuznými druhmi • duplikácie genómu • inverzie • translokácie/fúzie

44. Duplikácia genómu (tetraploidizácia) • Duplikácia genómu vedie k prechodnej tetraploidii, pokiaľ sa chromozómovou divergenciou neobnoví diploidia • V línii vedúcej k stavovcom genómová duplikácia sa vyskytla pravdepodobne dvakrát

45. Paralogické segmenty na chr. 12 a 17 Paralogické segmenty chr. 12 a 17 sú asi pozostatkom dávnej genómovej duplikácie

46. Evolúcia chromozómov – pokr. • čím vzdialenejšie druhy, tým nižší rozsah konzervácie synténie • medzi človekom a myšou je to okolo 10 Mb (výnimku tvorí X chr., väčšina ľudských sekvencií má ortologické sekvencie na X chr. myší)

47. Rozdiely medzi príbuznými druhmi čínsky muntjac – 46 chr. indický muntjac – samec 7 chr., samička 6 chr.

48. Porovnávacia cytogenetika primátov • výrazná podobnosť v štruktúre morfológii a vo vzoroch prúžkov chromozómov medzi človekom a vyššími primátmi (šimpanz, gorila, orangutan) • počet chromozómov • primáti: 24 párov • človek: 23 párov • chr. č. 2 u človeka – výsledok fúzie 2 akrocentrických chrom. u šimpanza • dôkaz: repetitívne telomerické sekvencie a ich orientácia u človeka, pozostatky 2 centromér chr. š. • identický prúžkový profil u všetkých 4 druhov na chr. 6, 13, 19, 21, 22 a X • veľká podobnosť chr. 3, 11, 14, 15, 18, 20 a Y u človeka, šimpanza a gorily • úsek cca 100kb u čl. a š. translokovaný z chr. 1 na Y (u gor. a oran. to nie je) • väčšina rozdielov sú typu inverzií, ale vyskytujú sa aj translokácie

49. Chromozómy u primátov Vznik chr. 2 u človeka fúziou 2 akrocentrických chr. šimpanza H – človek C – šimpanz G – gorila O - orangutan

50. Chromozómy u primátov Pericentrická inverzia chr. 5 u šimpanza