Proteomas e Espectrometria de Massa

1. BIO10-329 Biofísica de Proteínas Regente: Célia R. Carlini Proteomas e Espectrometria de Massa Atenção ! Use o modo “apresentação de slides” para ativar as animações

2. Componentes Nº de moléculas diferentes % peso total H2O 1 70 Proteínas 3.000 15 Ac. Nucléico 1 - DNA e 1000-RNA 7 Carbohidratos 50 3 Lipídeos 40 2 Outros Íons - 12 3 Mol. Monoméricas - 500 Principais componentes moleculares da bactéria E. coli A tabela mostra a percentagem em peso dos principais tipos de moléculas presentes em um célula simples, a bactéria Escherichia coli. Observe que as proteínas compõem o grupo mais diverso de moléculas. Antes das técnicas de proteômica, para se obter informações sobre uma proteína em particular, era necessário separá-la de todas as outras que estão presentes na mesma fonte biológica. Atualmente, é possível analisar-se um grande conjunto de proteínas ao mesmo tempo, e obter informações de uma proteína em particular sem separá-la das demais, graças às técnicas de espectrometria de massa acoplada com eletroforese 2D e/ou cromatografia líquida.

3. Atualmente, a capacidade de processamento de grandes volumes de informações e técnicas analíticas de alta resolução, entre as quais se destaca a espectometria de massas, permitem o estudo de células e organismos inteiros – são os “OMAS. • METABOLOMA - metabólitos Homo sapiens • GENOMA – DNA – 3,4 bilhões de nt • TRANSCRIPTOMA – mRNA – 30 mil genes • PROTEOMA – Proteínas – 0,3-1,2 milhão proteínas • INTERACTOMA – interações entre proteínas • SIGNALOSOMA – interações entre proteínas de uma via de sinalização

4. Do geral para o particular Analisar diversos proteomas em condições diferentes e identificar as diferenças Do particular para o geral Analisar uma única proteína e inferir suas funções no contexto do todo Estratégias experimentais Separação de proteínas nas amostras Eletroforese bidimensional Cromatografia líquida (LC) fragmentação Determinação de massas para identificação Peptide mass fingerprint Sequenciamento de novo

5. Proteínas com a mesma massa Proteínas com mesmo pI ELETROFORESE BIDIMENSIONAL: • análise simultânea de até 5.000 proteínas • permite comparação de todas as proteínas expressas por uma célula em dois momentos diferentes: • análise do efeito de hormônios, • análise do efeito de drogas; • estados fisiológicos (desenvolvimento); • condições patológicasdiversas (vírus, • bactérias,etc.) Eletroforese 2D de proteínas totais (proteoma) de células de Escherichia coli

6. Proteoma Comparativo ou Diferencial condição condição Sobreposição permite identificar diferenças nos padrões de bandas

8. Sobreposição para análise das proteínas diferentemente expressas Proteínas de cada condição são marcadas com tags fluorescentes diferentes para facilitar a visualização das diferenças

9. Interatoma de C. elegans - proteínas individuais, representadas por círculos, agrupam-se (indicado por linhas) conforme suas interações, formando uma rede quepermite entender detalhes do controle das funções vitais do organismo.

10. Tripsinização virtual Fragmentar com tripsina Banda removida do gel Espectro de massas dos fragmentos virtuais Identificação de Proteínas por MS: 10 passos (1) (2) (3) Obter espectro de massas dos fragmentos (4) (9) comparação (8) Banco de espectros Identificação (10) Espectro de massas Banco de seqüências (i.e. SwissProt) (5) (6) (7)

11. Peptide fingerprint ou impressão digital de peptídeos: proteínas são identificadas com base no tamanho dos peptídeos resultantes da hidrólise com tripsina, comparando-se o espectro de massa real com o teórico, obtido a partir dos bancos de dados de proteínas. Massa/cargaMassTolerance (Da)# Hits in Database Quanto maior a exatidão da medida de massas, maior a segurança na identificação da proteína (hits) que originou os peptídeos trípticos.

12. Impressão digital de peptídeos: efeito de peptídeos múltiplos Massa/cargam/z Mass Tolerance # Hits Database 2 peptídeos 3 peptídeos A identificação de mais de um peptídeo triptíco de uma mesma proteína aumenta a confiabilidade da identificação dessa proteína por espectrometria de massa.

13. Espectrometria de Massas Thomson, 1897 – fez descoberta do elétron e inventou a espectrometria de massa, com a primeira medida da razão massa/carga de uma partícula. Prêmio Nobel de Química, 2002 – foi para os inventores de métodos de ionização branda em espectrometria de massa, que permitiu análise de macromoléculas como proteínas John B. Fenn (E.U.A.) - Electrospray (ESI) Koichi Tanaka (Japão) - Soft Laser Desorption (SLD). Espectrômetros de massas usam diferenças na razão massa-carga (m/z) de átomos ou moléculas ionizadas para separá-los, e/ou para determinar a composição e a estrutura química. Moléculas fragmentam-se de maneiras diferentes, sendo que a análise MS dos fragmentos permite sua caracterização estrutural. O poder de separação de íons de um MS é descrito por sua resolução, que é definida como: R = m /D m sendo m, a massa do íon Dm, a diferença de massa entre dois picos no espectro de massa Ex: um MS com resolução de 1000 consegue separar íons com m/z de 100.0 e 100.1

14. A massa de uma molécula pode ser determinada a partir dos m/z de quaisquer dois picos vizinhos, que diferem por 1 carga (+) ou 1 próton: (m/z)1 = M + n2x n2 M é a massa da molécula n2 é o número de cargas X é a diferença entre dois picos (m/z)2 = M + (n2x +1)X n2 + 1 Temos duas equações e dois desconhecidos, M e n2, que podem ser calculados resolvendo-se esse sistema de equação: n2 = (m/z)2 – X (m/z)2 – (m/z)1 M = n2 [(m/z)2 – X] O espectro de massas de uma molécula consiste de uma família de picos, correspondendo a espécies carregadas que diferem de 1 unidade de massa e carga. A “deconvolução” desses picos, gerando o gráfico acima, dá a massa de uma molécula com precisão de 0,01%

15. Analisadores de massa MS de setor magnético: Ionização: um feixe de elétrons de alta energia é utilizado para ejetar um elétron de uma molécula, formando um radical catiônico designado como íon molecular. Se o íon molecular for muito instável ele poderá se fragmentar em íons menores. Analisador de massa: os íons moleculares são focalizados, formando um feixe, são acelerados através de um campo magnético, sendo defletidos (desviados) de acordo com as massas dos íons.

16. Analisadores de massa Quadrupolo - consiste de quatro eletrodos (tubos metálicos), dois positivos e dois negtivos. A voltagem aplicada afeta a trajetória de íons passando através aos eletrodos. Para uma dada condição de corrente e voltagem, somente íons com uma dada razão massa/carga seguem o trajeto entre os tubos, e todos os outros são desviados para fora do quadrupolo. Obtem-se um espectro de massas variando-se gradualmente a corrente e voltagem para detectar-se todos os íons presentes. MS quadrupolo de transmissão: consiste de um ionizador, lentes para acelerar e focalizar os íons para a entrada no quadrupolo, o quadrupolo com controles de V e A, um detector de íons. Todo o sistema necesssita de alto vácuo. Resolução: separa íons com diferenças de 0.3 m/z

17. A equação que governa a separação de íons por TOF é: m/z razão massa/carga do íonE potencial do pulso de extraçãos comprimento do setor em que E é aplicadod comprimento do tubo de vôot tempo de vôo do íon Analisadores de massa A energia cinética de um íon é 0.5mv2, assim ions mais leves têm velocidade maior que os pesados e atingem o detector em menos tempo. MS-TOF MS tempo de vôo: íons são acelerados a partir do ionizador até um tubo de vôo, sem campo elétrico ou magnético, onde se movem na direção do detector com uma velocidade proporcional a m/z. Ao contrário de outros MS, não há limite superior de detecção de m/z. O TOF-MS é afetado pela energia inicial dos íons antes de serem acelerados. Para corrigir, utiliza-se um conjunto de campos elétricos, o reflectron, que refocalizam os íons de mesma m/z com velocidades diferentes. É o mais preciso de todos os MS, permitindo análise elementar. Podem fazer até 100 espectros por segundo. Originalmente desenvolvido na década 1950, foi obscurecido pelos MS quadrupolos até o desenvolvimento do MALDI nos anos 1980.

18. Espectrômetro de massa por tempo de vôo

19. Analisadores de massa MS Íon-trap: formado por um quadrupolo tridimensional Consiste de eletrodos cilíndricos simétricos, que formam dois “end caps” e um anel. Pode ser bastante pequeno, com somente 1-2 cm separando os eletrodos. A face interna de cada eletrodo tem uma superfície hiperbólica. Uma corrente e voltagem são aplicadas ao eletrodo em forma de anel, enquanto os “end caps” ficam aterrados. De maneira análogo ao MS quadrupolo linear, variando-se a voltagem ocorrem rápidas inversões na direção do campo, com os íons sendo alternadamente acelerados e desacelerados na direção axial e vice versa na direção radial, aprisionando-os. Aumentando-se a voltage, os íons assumem trajetórias instáveis e saem do trap, numa ordem de m/z crescente. Ainda que a resolução do MS ion trap seja mais baixa, apresenta como vantagem a pré-concentração do íon de interesse antes da análise.

20. Técnicas de Ionização Ionização por impacto de eléctrons (EI) As moléculas são vaporizadas e bombardeadas com elétrons de alta energia (70 eV), formando de íons moleculares (+) quando esses elétrons colidem com a molecula e deslocam eléctrons mais externas. Alguns desses íons são instáveis e de fragmentam em íons menores. Adequada para compostos não termolábeis. Dessorpção por Laser assistida por matriz (Matrix Assisted Laser Desorption) (MALDI):       Técnica desenvolvida por Karas e Hillkamp em 1988, para ionização de peptídeos e proteínas, oligossacarídeos, glicolipídeos, nucleotídeos, etc. As amostras são co-cristalizadas com uma matriz (substância que absorve luz ultravioleta). Para proteínas, utiliza-se o ácido sinapínico, que absorve a radiação de 337 nm do laser de nitrogênio. A energia absorvida pela matriz é transferida para as moléculas, evitando sua decomposição por calor. Após a incidência do pulso de laser, uma grande quantidade de energia é absorvida pela matriz e há uma "explosão" com emissão de um gás com íons moleculares com uma carga.

21. Técnicas de Ionização Mass Spectrometry Matrix-assisted laser desorption ionizaton – time of flight Maldi-Tof

22. Técnicas de Ionização Ionização por electronspray(ESI) Método adequado para análise de moléculas termolábeis, como proteínas. O processo de ionização das moléculas ocorre pela nebulização de gotículas (nanolitros) de uma solução em um campo elétrico intenso, formando gotículas altamente carregadas. Quando o solvente evapora, formam-se íons moleculares de simples ou múltiplas cargas. Podem ser formados íons (-) ou (+), de acordo com o campo eléctrico aplicado. No modo positivo, observam-se adutos alcalinos (protonados) dos analitos e no modo negativo, os íons são desprotonados.

23. Sequenciamento de novo de proteínas por espectrometria de massas Para sequenciar proteínas é preciso obter o espectro MS/MS de seus peptídeos. Isso significa 2 etapas de MS acopladas. Depois de fazer o MS da molécula inteira, esta é fragmentada dentro do aparelho por colisão com gases. Os fragmentos são então separados e analisados por MS. hélio ou argônio A ligação peptídica se quebra formando fragmentos típicos, como os íons b e y mostrados na figura acima, que terão massas diferentes de acordo com o radical R de cada aminoácido.

24. Sequenciamento de novo de proteínas Quando um peptídeo é analisado por MS/MS, a fragmentação gera uma família de fragmentos peptídicos com massas que vão diferir uma da outra em valores que correspondem a um íon b, permitindo a identificação de cada aminoácido.

25. Sequenciamento de novo de proteínas A sequência obtida pela análise dos íons de uma série pode ser confirmada pela determinação da sequência feita a partir da série complementar de íons, no caso do exemplo, os íons y.

26. Espectro MS/MS do peptídeo tríptico GLSDGEWQQVLNVWGK. Analiza-se o espectro buscando diferenças de m/z equivalentes a um resíduo de aminoácido, que permitem conhecer a seqüência do peptídeos

27. perda de H2O = 18 u.m. perda de CO2= 28 u.m. Sequenciamento de novo Íons y perda de amônia = 17 u.m. Íons b e a Espectro MS/MS do peptídeo GLSDGEWQQVLNVWGK.

28. http://prospector.ucsf.edu/ http://db.systemsbiology.net:8080/proteomicsToolkit/index.html  http://www.ionsource.com/