MUTÁCIÓ ÉS KIMUTATÁSI MÓDSZEREI

1. MUTÁCIÓ ÉS KIMUTATÁSI MÓDSZEREI

2. MUTAGÉN • Az emberi szervezetre, annak természetes és mesterséges környezetéből nagyszámú toxikus tényező fejtheti ki hatását, melyek egy része a sejtek genetikai állományát is károsítja! • Egyik lehetséges mód: MUTÁCIÓ • Watson és Crick 1953: DNS kettős spirálszerkezetének és önreprodukciós képességének kimutatása

3. DNS kettős spirál szerkezete

4. Szemikonzervatív replicatio: DNS sejtosztódás előtti megkettőződése • Szemikonzervatív, mert az egyik lánc az eredeti DNS molekulából származik a másik újonnan szintetizálódik • DNS replicatio során létrejöhetnek „hibák” mutációk következő megkettőződéssel továbbadódik, ha nem keletkezik ellentétes mutáció (reserv) • Mutáció a genom megváltozása • Gyakorlati szempontból: pontmutáció, kromoszóma aberratio • A legtöbb mutáció spontán és váratlan

5. DNS-molekula szemikonzervatív replicatioja

6. Benignus polimorfizmus A kimutatott mutációnak ‘nincs’ klinikai relevanciája Genetikai értelemben akkor használjuk, amikor olyan mutációt takar, amelyek genetikailag még nem mutathatók ki azon egyéneknél akiknél a klinikai relevanciák megtalálhatók Kockázati mutáció A betegség kialakulását nem okozza, de a betegség kialakulásához hozzájárul a jelenléte

7. Mutáció szűrési módszerek A mutáció szűrési eljárások során keressük a betegséget / szindrómát okozó mutációt, vagyis a mutáció elváltozás / betegség kapcsolatot derítjük fel! Linkage analízis: Eltérő DNS polimorfizmusokat keresünk a beteg és a kontroll DNS-ében Ismert mutáció kimutatása: annak eldöntésére végezzük, hogy az illető a kérdéses megbetegedésben szenved-e, vagy annak kockázatát hordja-e a génszerkezetében Ez a leggyakrabban használt eljárás A betegségért felelős mutáció keresése:Keressük az adott betegségben szenvedők adott génjében azokat a mutációkat, amelyek csak a betegeknél mutathatók ki

8. A betegségért felelős mutáció(k) keresési stratégiája • A gén adott szakaszait PCR reakcióval amplifikáljuk • Az így nyert DNS-ben mutáció szűrési eljárásokkal mutációt keresünk • A mutációt nukleotid szekvencia analízissel azonosítjuk • Vizsgáljuk, hogy a talált mutáció benignus polimorfizmus, vagy betegségért felelős mutáció • Vizsgáljuk a mutáció hatását a DNS szekvenciára, aminosav összetételre, fehérje szerkezetre

9. Mutáció szűrési eljárások • DGGE: Denaturáló grádiens gél elektroforézise • TGGE: Hőmérséklet grádiens gél elektroforézise • SSCP: Egyszálú DNS konformációs változatai • Heteroduplex analízis • CFLP:Heteroduplexek vágása 1.Kémiai módszerrel történő vágás 2.Enzimatikus módszerrel történő vágás 3.Speciális enzimmel történő vágás • Mismatch binding proteinek kötődésén alapuló eljárás • PTT

10. TGGE: Hőmérséklet grádiens gél elktroforézise

11. SSCP: Egyszálú DNS konformációs változatai

12. A mutáció azonosítása nukleotid szekvencia analízissel 1.A kérdéses gén szakaszról PCR segítségével másolatot készítünk 2.A PCR azonosságát és tisztaságát ellenőrizzük 3.Nukleotid szekvencia meghatározás 4.A szekvenálást mindkét irányból el kell végezni 5. A mutáns és kontroll szekvenciájának összehasonlítása

13. PCR: polimeráz láncreakció

14. Heterozigóta mutáció kimutatás PCR-SSC, nukleotid szekvencia analízissel Pedigre PCR-SSCP analízis Heterozigóta mutáns szekvencia Vad nukleotid szekvenciája

15. PCR-SSCP

16. Felhasznált irodalom: Dr. Papp Zoltán: Klinikai genetika DE-OEC: Alapvető Molekuláris Biológiai Módszerek (Debrecen 2003.) Kép: Internet Készítette: Kolocsán Tünde Biológia-környezetvédelem II. évfolyam Nyíregyháza, 2004. November 13.

17. KÖSZÖNÖM A FIGYELMET!