Introducción a la Espectrometría de Masa

1. Introducción a la Espectrometría de Masa Algunas aplicaciones de la Espectrometría de Masaen biología y biomedicina

2. Espectrometría de Masa • La Espectrometría de Masa es una técnica que permite determinar la masa de moléculas por medio de la medida de la relación masa/carga (m/z). • La medida de masas moleculares involucra la producción, separación y detección de iones moleculares en fase gaseosa. • Cada molécula puede originar iones moleculares con distinto número de cargas ( y distintas m/z). • La masa molecular es una propiedad física fundamental e inalterable de la materia……

3. Bioespectrometría • Aplicación de la Espectrometría de Masa al estudio de bio-moléculas: identificación, niveles, modificaciones. • Incluye la combinación de herramientas de la Bioquímica (cromatografía, electroforesis, bioafinidad y digestiones enzimáticas, entre otras) con la Espectrometría de Masa.

4. Espectrometría de masa y Biología • Las medidas de masa de péptidos y proteínas (...y de otras macromoléculas) eran extremadamente difíciles de realizar hasta fines de los años 80’, cuando aparecieron dos nuevos métodos para producir iones en fase gaseosa: • Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI), para muestras sólidas • Ionización por “Electrospray” (ESI) para muestras líquidas

5. Espectrometría de masa: equipos de tipo MALDI-TOF Espectrómetro de masa MALDI-TOF (Applied Biosystems Voyager DE-PRO) Espectrómetro de masa MALDI TOF/TOF (Applied Biosystems 4800 Analizer)

6. Linear Extraction plate Reflector detector grids detector Timed ion selector Reflector Laser Beam guide Camera Pumping Pumping ESQUEMA:Instrumento de tecnología MALDI-TOF

7. Analizador de masa TOF Aceleración post-irradiación láser Detector Región de deriva (Tubo de vuelo) +20 kV Iones de masas diferentes L os iones se separan de acuerdo a sus relaciones de m/z, de manera que los iones más livianos reciben una mayor aceleración . Los iones más livianos llegan al detector antes que los iones de masas mayores. La medida del “tiempo de vuelo” (TOF) de cada uno se puede usar para calcular su masa.

9. Espectro de masa por MALDI-TOF de péptidos generados por digestión con tripsina “in gel” de una proteína de membrana de 91kDa. Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81

11. 1672.92 Modo lineal Resolucion: 2467 (FWHM) Modo reflector Resolucion:8500 (FWHM) Resolución en MALDI-TOF

14. Voyager Spec #1=>MC[BP = 2469.5, 12005] % Intensity 2xC13 Espectro de masa con resolución isotópica de insulina bovina. (aprox. 0.15 pmoles, 0.8 ng, en 1 ml de muestra; matriz: CHCA; R= 13800 FWHM) 2093 100 C13 90 80 70 60 C12 50 40 30 20 10 0 0 5725 5729 5733 5737 5741 5745 Mass (m/z)

15. Algunas aplicaciones............

16. CARACTERIZACIÓN DE PROTEÍNAS POR ESPECTROMETRÍA DE MASA Identificación de proteínas comparación correlativa en una base de datos de secuencias Control de calidad proteínas recombinantes, reacciones de modificación Modificaciones postraduccionales fosforilación, glicosilación, metilación, etc. Identificación de dominios dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima Niveles de expresión métodos cuantitativos

17. Voyager Spec #1=>BC=>NF0.9[BP = 12364.9, 60367] 12366.46 6.0E+4 100 90 80 6187.17 70 12583.58 60 50 % Intensity 12326.17 40 30 6292.68 20 12784.48 10 0 0 5000 7000 9000 11000 13000 15000 Mass (m/z) Espectro de masa del citocromo c de caballo A. Molécula entera. Matriz: ácido sinapínico

18. Mapeopeptídicopor EM(Peptide Mass Fingerprinting/MS) péptidos proteínaintacta enzimaproteolítica MEMEKEFEQIDKSGSWAAIYQDIRHEASDFPCRVAKLPKNKNRNRYRDVS PFDHSRIKLHQEDNDYINASLIKMEEAQRSYILTQGPLPNTCGHFWEMVW EQKSRGVVMLNRVMEKGSLKCAQYWPQKEEKEMIFEDTNLKLTLISEDIK SYYTVRQLELENLTTQETREILHFHYTTWPDFGVPESPASFLNFLFKVRE SGSLSPEHGPVVVHCSAGIGRSGTFCLADTCLLLMDKRKDPSSVDIKKVL LEMRKFRMGLIQTADQLRFSYLAVIEGAKFIMGDSSVQDQWKELSHEDLE PPPEHIPPPPRPPKRILEPHNGKCREFFPNHQWVKEETQEDKDCPIKEEK GSPLNAAPYGIESMSQDTEVRSRVVGGSLRGAQAASPAKGEPSLPEKDED HALSYWKPFLVNMCVATVLTAGAYLCYRFLFNSNT

19. Voyager Spec #1=>MC=>BC[BP = 1633.6, 19883] 2.0E+4 163 3 . 8 2 100 1168.61 90 80 70 60 % Intensity 50 1190.54 40 1212.53 1433.76 30 1655.59 1170.18 1213.53 20 1296.68 1152.36 1046.18 1631.62 1350.70 1478.82 1124.52 1230.50 10 0 0 1000 1160 1320 1480 1640 1800 Mass (m/z) B. Molécula digerida con tripsina. Matriz: ácido -ciano hidroxicinámico

20. RESUMEN:Niveles de información……… en la caracterización de proteínaspor MS. • medida de masa de una molécula entera 1 valor experimental • medidas de masas en mapeo peptídico5-20 valores experimentales • secuenciado de péptidos por MS/MS más de 100 valores experimentales …mejora en cantidad y calidad de la información

21. ADN Genoma mARN Control transcripcional El Proteoma es dinámico Estado metabólico Drogas Interacciones Proteína-Proteína Condiciones ambientales Proteoma Estrés Estadío de Desarrollo Control traduccional y post-traduccional

22. Análisis por electroforesis 2D

23. Identificación de proteínas m/z Extracción de péptidos y análisis de masas Separación en gel 2D Selección de la muestra Tratamiento con una enzima proteolítica Búsqueda en banco de datos 1000 1500 2000 Mass (m/z)

24. Protein Prospector HomepageMS-Fit Search

25. ProFound Search for Protein Identification Enzyme used for digestion Set Kingdom Cys Modificatition (reduced, alkylated) Set Charge state

26. Search Result after Peptide Mass Fingerprinting The result showed that in fact the spot contained 2 proteins. Both were identified, Vimentin and Tubulin. Up to 5 proteins in the same spot could potentially be identified. Note that the genome of CHO-cells (hamster) is notsequenced. Therefore the most homologues proteins of related species are scored.

27. Detailed Search Results View

28. Identificación de una proteína regulada por hierro en membrana externa de Sinorhizobium meliloti Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81

29. FIG. 1. SDS-PAGE analysis of S. meliloti 242 outer membrane proteins. S. meliloti 242 was grown in M3 medium containing 37 µM FeCl3 (lanes 1 and 2), 500 µM EDDHA (lanes 3 and 4), 500 µM EDDHA and 4 µM hemoglobin (lanes 5 and 6), or 500 µM EDDHA and 16 µM hemin (lanes 7 and 8). Outer membrane proteins were extracted as described in the text, electrophoresed in a 10% acrylamide gel, and stained with 0.1% Coomassie brilliant blue. The bracket indicates the position of IROMPs. The positions of molecular mass standards (in kilodaltons) (lane 0) are indicated on the left. St, standards; Hb, hemoglobin; Hm, hemin. Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81

30. FIG. 3. Mass spectrum of the 91-kDa outer membrane protein digested in-gel with trypsinobtained by MALDI-TOF mass spectrometry. Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81

32. Appl Environ Microbiol 2002 Dec;68(12):5877-81

33. Identificación de proteínas por MALDI-TOF • Proteína aislada • Proteína identificada por la masa de los péptidos (PMF), generados por un método específico: • Enzimático o químico • Para su identificación, la secuencia de la proteína debe estar en una base de datos • La identificación es probabilística: según criterios estadísticos

34. Caracterización de proteínas por espectrometría de masa Identificación de proteínas comparación correlativa en una base de datos de secuencias Control de calidad proteínas recombinantes, reacciones de modificación Modificaciones postraduccionales fosforilación, glicosilación, metilación, etc. Identificación de dominios dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima Niveles de expresión métodos cuantitativos

35. Identificación de Proteínas de Células Huésped en materia prima del Factor G-CSF Pureza/SDS-PAGE/ GCSF Pureza/HPLC/GCSF 36 29 24 20 14 A B B A

36. Identificación de Proteínas de Células Huésped en materia prima del Factor G-CSF 28.952 Da muestra A A B Espectro de masa por MALDI-TOF, del contaminante proteico (spot A en gel 2D). Electroforesis 2D de la materia prima

37. Identificación de Proteínas de Células Huésped en materia prima del Factor G-CSF Digestión tríptica: muestra A Realizado por la Unidad de Bioquímica Analítica del IIBCE/ Laboratorios CLAUSEN

38. Caracterización de proteínas por espectrometría de masa Identificación de proteínas comparación correlativa en una base de datos de secuencias Control de calidad proteínas recombinantes, reacciones de modificación Modificaciones postraduccionales fosforilación, glicosilación, metilación, etc. Identificación de dominios dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima Niveles de expresión métodos cuantitativos

39. Identificación de Modificaciones Postraduccionales Fosforilación? NO2?

40. Common Protein Post-Translational Modifications ∆ (monoisotopic)modification -17 pyrrolidone carboxylic acid -2 disulfide formation (thiol oxidation) -0.98 amidation 0.98 deamidation 2 disulfide reduction (thiol formation) 14 methylation 16 oxidation (e.g. sulfoxide formation) 28 formylation 42 acetylation 43 carbamylation 44 g-carboxyglutamic acid 71 Cys-propionamide 79.9568 sulfation 79.9663 phosphorylation Some modifications are natural. Many are the result of handling. disulfide vs. two thiols phosphate group vs. sulfate group good mass spectrometer needed especially with large molecules M. R. Wilkins et al., J. Mol. Biol. 289: 645-657 (1999). Delta Mass at http://www.abrf.org

41. Identificación de sitios de fosforilación PknB de Mycobateriumtuberculosis 1 GSSHHHHHHSSGLVPRGSHMTTPSHLSDRYELGEILGFGGMSEVHLARDLRLH 51 RDVAVKVLRADLARDPSFYLRFRREAQNAAALNHPAIVAVYDTGEAE 101 TPAGPLPYIVMEYVDGVTLRDIVHTEGPMTPKRAIEVIADACQALNFSHQ 151 NGIIHRDVKPANIMISATNAVKVMDFGIARAIADSGNSVTQTAAVIGTAQ 201 YLSPEQARGDSVDARSDVYSLGCVLYEVLTGEPPFTGDSPVSVAYQHVR 251 EDPIPPSARHEGLSADLDAVVLKALAKNPENRYQTAAEMRADLVRVHNGEP 301 PEAPKVLTDAERTSLLSSAAGNLSGPRTDPLPRQDLDDTDRDRSIGSVGR

43. 1 GSSHHHHHHSSGLVPRGSHMTTPSHLSDRYELGEILGFGGMSEVHLARDLRLH 51 RDVAVKVLRADLARDPSFYLRFRREAQNAAALNHPAIVAVYDTGEAE 101 TPAGPLPYIVMEYVDGVTLRDIVHTEGPMTPKRAIEVIADACQALNFSHQ 151 NGIIHRDVKPANIMISATNAVKVMDFGIARAIADSGNSVpTQpTAAVIGTAQ 201 YLSPEQARGDSVDARSDVYSLGCVLYEVLTGEPPFTGDSPVSVAYQHVR 251 EDPIPPSARHEGLSADLDAVVLKALAKNPENRYQTAAEMRADLVRVHNGEP 301 PEAPKVLTDAERTSLLSSAAGNLSGPRTDPLPRQDLDDTDRDRSIGSVGR

44. Caracterización de proteínas por espectrometría de masa Identificación de proteínas comparación correlativa en una base de datos de secuencias Control de calidad proteínas recombinantes, reacciones de modificación Modificaciones postraduccionales fosforilación, glicosilación, metilación, etc. Identificación de dominios dominios estructurales funcionales, pro-enzima vs. enzima Niveles de expresión métodos cuantitativos

45. 2-D DE T. cruzi- RESULTADOS PRELIMINARES A) pH 3 10 B) pH 3 10 Epimastigotes CL-Brener (vista parcial) A) y B) tratados y no tratados con H2O2 respectivamente

46. Proteína Enzima Mezcla de péptidos Espectrómetro de masa Alternativamente, secuenciación de cada péptido Masa de los péptidos Búsqueda en bancos de datos; Identificación de la proteína Verificación de secuencia y detección de modificaciones postraduccionales .…MS/MS ESTRATEGIA GENERAL PARA EL ANÁLISIS DE PROTEÍNAS POR ESPECTROMETRÍA DE MASA

47. MS/MS 1 péptido seleccionado para MS/MS Mezcla de péptidos + + MS/MS + + + + Espectro MS/MS: masa de los fragmentos Espectro MS

48. b ions y ions

50. Del Genoma al Proteoma Secuencia ADN Proteínas Funcionales mARN Proteínas Control post-traduccional Control Transcripcional Control Traduccional Algunas propiedades VITALES de las proteínas no pueden ser predecidas de su secuencia de ADN