EXPERIMENTAL CLINICAL STUDY OF LIVER REDOX

1. EXPERIMENTAL CLINICAL STUDY OF LIVER REDOX STATUS INDUCED BY ISCHEMIA-REPERFUSION INJURY DURING HEPATIC SURGERY: ANALYSIS OF HEMATIC AND TISSUTAL PARAMETERS. Guzzetti E., Ferla F., Milani F., Accinni R., Aldrighetti L., Catena M., Ferla G. Liver Unit - Dipartimento di Chirurgia Istituto Scientifico San Raffaele Università Vita-Salute San Raffaele Milano

2. Controllo del sanguinamento intraoperatorio: occlusione intermittente del peduncolo vascolare epatico Trasfusioni intraoperatorie di emazie concentrate o plasma fresco congelato sono associate ad un peggioramento prognostico. 1, 2 Occlusione intermittente del peduncolo vascolare epatico (manovra di Pringle): chiusura con uno strumento emostatico dell’intero ilo portobiliare (v.porta, a.epatica, via biliare) 1: Koobi DA, et al. Influence of transfusion on perioperative and long term outcone in patients following hepatic resection for colorectal metastases. Ann Surg 2003;237:860-870 2: Wu CC, et al. Prediction and limitation of hepatic tumor resection without blood transfusion in cirrhotic patients. Arch Surg 1998;133:1007-1010

3. Danno da ischemia e riperfusione (IR)Specie reattive dell’ossigeno • Danno da ischemia e riperfusione: caratterizzato da sofferenza epatocitaria, attivazione delle cellule di Kupffer e infiltrazione leucocitaria epatica 3. • Produzione di radicali liberi: specie reattive di ossigeno ed altri elementi in grado di danneggiare varie strutture cellulari (DNA, proteine, lipidi) 4. • Sistema antiossidante endogeno: molecole ed enzimi in grado di ridurre il danno indotto dai radicali liberi 5. 3: Jaeschke H Molecular mechanisms of hepatic ischemia-reperfusion injury and preconditioning. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 2003;284:G15-G26 4: Bayir H Reactive oxygen species. Crit Care Med 2005;33(12):S498-S501. 5: Glantzounis G, et al. The contemporary role of antioxidant therapy in attenuating liver ischemia-reperfusion injury: a review. Liver Transpl 2005;11:1031-1047.

4. Glutatione (GSH) (L-g-glutamil-L-cisteinilglicina) • Tripeptide tiolico dotato di sito attivo SH in cisteina che può essere ossidato e ridotto. • Tra i suoi precursori abbiamo cisteina e cisteinil glicina 6. Glutatione Perossidasi (GPx) H2O2 2 H2O 2 GSH GSSG 2 NADP+ + 2H+ 2 NADPH Glutatione Reduttasi (GR) 6: Wu G, et al. Glutathione metabolsim and its implication for health. J Nutr 2004;134:489-492.

5. Studio Clinico Sperimentale SCOPO: studiare le variazioni dello stato redox cellulare, indotte dall’insulto ischemico-riperfusorio, analizzando le alterazioni del GSH e dei suoi precursori a livello tissutale epatico e a livello plasmatico. PAZIENTI: • Totale: n°43. • Gruppo P: n° 36 (occlusione del peduncolo vascolare eseguita) • Gruppo NP: n°7 (occlusione del peduncolo vascolare non eseguita – controllo)

6. Campioni tissutali- prelievo di biopsie epatiche con il seguente timing: • T1: prima della fase ischemica • T2: dopo 10 min. di ischemia • T3: dopo 20 min. di riperfusione MATERIALI E METODI: MODALITA’ DI CAMPIONAMENTO Campioni plasmatici– prelievo di 12 ml di sangue venoso con il seguente timing: • T1: preoperatorio • T2: al termine dell’intervento • T3: 1a giornata postoperatoria • T4: 4a giornata postoperatoria Campionamento eseguito presso l’U.F. di Chirurgia Generale Epatobiliare – Liver Unit (HSR) in collaborazione con il Dipartimento di Chirurga dell’Università degli Studi di Milano (H.Sacco)

7. MATERIALI E METODI Campioni tissutali • Cisteina (ridotta e totale) • Cisteinil-glicina (ridotta e totale) • Glutatione (ridotto e totale) • Attività dell’enzima Glutatione perossidasi • Attività dell’enzima Glutatione reduttasi Campioni plasmatici • Cisteina • Cisteinil-glicina • Glutatione • Attività dell’enzima Glutatione perossidasi • Attività dell’enzima Glutatione reduttasi • Analisi eseguite presso il Laboratorio di Biochimica Clinica – • Istituto di Fisiologia Clinica CNR (H.Niguarda)

8. RISULTATI:CARATTERISTICHE DELLA POPOLAZIONE

9. RISULTATI:RESEZIONI EPATICHE

10. RISULTATI:OUTCOME PERIOPERATORIO

11. DATI BIOCHIMICI Come varia la concentrazione degli antiossidanti tiolici in seguito a danno ischemico-riperfusorio?

12. RISULTATI: ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI - CISTEINA, CISTEINIL-GLICINA, GLUTATIONE Gruppo P Gruppo NP  Riduzione delle concentrazioni tissutali di glutatione e dei suoi precursori

13. Come varia lo stato ossidoriduttivo degli antiossidanti tiolici in seguito a danno ischemico-riperfusorio?

14. RISULTATI: ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI - STATO REDOX DI CISTEINA, CISTEINIL-GLICINA, GLUTATIONE • Nel gruppo P miglioramento del rapporto tra forma ridotta e totale dei composti tiolici, e soprattutto del glutatione. Perché aumenta la concentrazione di GSH ridotto?

15. RISULTATI: ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI - STATO REDOX DEL GLUTATIONEATTIVITA’ DELLA GLUTATIONE REDUTTASI  Lieve incremento dell’attività della glutatione reduttasi al termine della fase riperfusoria. Gruppo P Gruppo NP

16. CONCLUSIONI: ANALISI SU CAMPIONI TISSUTALI • Consumo di glutatione e dei suoi precursori. • Condizione intracellulare di stress ossidativo, con miglioramento dello stato ossidoriduttivo del glutatione al termine della fase riperfusoria (mantenuta attività dell’enzima glutatione reduttasi).  La scarsità di glutatione potrebbe essere il fattore limitante l’attività della glutatione reduttasi.

17. RISULTATI: CAMPIONI PLASMATICI CISTEINA, CISTEINIL-GLICINA, GLUTATIONE  Gruppo P  Gruppo NP Val. riferimento • Livelli basali preoperatori ridotti di GSH. • Consumo nell’immediato postoperatorio, seguito da un progressivo recupero. • Alterazioni più evidenti nel gruppo P.

18. Campione tissutale RISULTATI: CAMPIONI PLASMATICIATTIVITA’ DELLA GLUTATIONE REDUTTASI  Gruppo P  Gruppo NP Val. riferimento  Notevole incremento dell’attività dell’enzima glutatione reduttasi nel postoperatorio.

19. CONCLUSIONI: ANALISI SU CAMPIONI PLASMATICI • Livelli scarsi di GSH a livello basale preoperatorio. • Nelle giornate postoperatorie si assiste ad un progressivo incremento della concentrazione plasmatica di GSH e precursori, e ad un miglioramento del loro stato ossidoriduttivo (notevole aumento dell’attività della glutatione reduttasi).

20. CONCLUSIONI • Riscontro a livello preoperatorio di scarse riserve intracellulari di glutatione. • Consumo di precursori del glutatione, che impedisce la produzione del glutatione stesso. • Condizione intracellulare di stress ossidativo, con miglioramento dello stato ossidoriduttivo nelle giornate postoperatorie. • Simile trend di modifica delle concentrazioni tissutali e plasmatiche di GSH e precursori.