Eiwitzuivering 1

1. Eiwitzuivering 1 Werken met eiwitten Homogenisatie Detergentia Centrifugatie Zoutprecipitatie Dialyse Sigrid Beiboer en Ivo Horn TBEMH-P05IDB HC5

2. Eiwitzuivering volgen op gel Hoe zuiverder het eiwit, des te minder bandjes op gel

3. Eiwitzuivering volgen door enzymatische activiteit Hoe zuiverder het enzym (=eiwit), des te hoger zijn specifieke activiteit

4. Werken met eiwitten • Invloed temperatuur • Invloed pH = werken op ijs!!!!

5. Invloed temperatuur Temperatuur verhoging geeft: • Afname H-bruggen • Toename hydrofobe interacties tot 60ºC, daarna afname • Ontvouwen en expansie van eiwit • Disulfide uitwisseling • Eiwit aggregatie Eiwitten ‘au bain marie’ verwarmen

6. Invloed pH Hoe meer pH van oplossing afwijkt van pI van eiwit: • Toename lading van eiwit • Ontvouwen en expansie van eiwit • Disulfide uitwisseling • Eiwit aggregatie Eiwitten lossen beter in buffer op dan in water Toevoegen loog of zuur: voorzichtig! En bij voorkeur < 0,2 N

7. Stabiliserende stoffen Maken eiwitten meer compact Voorbeelden: • Glycerol • Sucrose • Zouten: NaCl, (NH4)SO4 • MPD (2-methyl-2,4-pentaandiol): kristallisatie

8. Bewaren van eiwitten - In droge vorm bij 4ºC Voor gebruik op KT laten komen! • In oplossing (niet te lage concentratie!): • bij 4ºC (lange tijd: NaN3 of filter steriliseren) • bij -20ºC of -80ºC (moet eiwit wel tegen kunnen!)

9. Eiwitten zijn zeer gevoelig; werken met eiwitten is lastiger dan met DNA Werk daarom altijd op ijs!

10. De verschillende stappen voor een eiwitisolatie uit biologisch materiaal: • Weefsel homogeniseren • Scheiden van bestanddelen • Isoleren van biomoleculen • Identificeren van biomoleculen

11. Waarom homogeniseren bij biochemische methoden? • Weefsel geschikt maken voor verdere behandeling • Fijn maken van materiaal • Eerste stap in de procedure van orgaan/weefsel tot molecuul

12. Verschillende homogenisatie methodes • Blenderen Blender • Drukpers French Press Teflon of Potter- Elvehjem homogenisator • Sonificeren Sonificator • Vriezen / ontdooien Vriezer of mengsel van droogijs/ethanol • Vermalen Stamper en mortier • Enzymatisch / osmose Zie ook Wilson & Walker §8.3.3 en Campbell & Farrell §5.1

13. Verschillende systemen • Geheel intact stuk weefsel/orgaan (vb. spier, lever, hart) • Biologische vloeistof (vb. bloed) • Biopt • Eukaryote cellen in kweek • Bacteriën, gisten, schimmels

14. Blenderen • Grof weefsel snijden/hakken • Voorbehandeling • Redelijke homogenisatie

15. Teflon homogenisator (Potter-Elvehjem) • Glazen buis met teflon stamper • Onder druk cellen tegen de wand van de buis drukken • Cellen springen open, moleculen in oplossing • Moleculen isoleren (centrifugeren) • Zeer goede, voorzichtige methode (celorganellen blijven intact)

16. French press • Celsuspensie in cilinder • Hoge druk toepassen • Cellen springen kapot • Isolatie van vloeistof • Centrifugatie om celdebris te scheiden van vloeistof met moleculen

17. Sonificeren • Omzetting voltage in elektrische energie (20 kHz, ultrasone trillingen) • Omzetting naar mechanische trillingen via probe • In de vloeistof: holtes en implosies • Schokgolf, destructie cellen • Bacteriën, eukaryote cellen, weefsel • Let op: verhitting! Altijd koelen ivm aanwezig eiwit

18. Mortieren • Vermalen tussen glas- of aluminiumpoeder • Geschikt voor kleine hoeveelheden bacteriën of gistcellen • Mortieren op ijs!

19. Osmotisch zwellen en/of enzymatisch • Hoge molariteit • Osmotische zwelling cellen • Cellen barsten open • Sucrose/glucose • EDTA helpt (desintegratie membraaneiwitten) • Enzym lysozym • Detergens: Triton X-100, ureum,..

20. Detergens als hulpmiddel Triton X-100 Ureum Guanidine-HCl SDS ß-mercaptoëthanol Dithiothreitol (DTT)

21. Ureum en guanidine Ureum vermindert hydrofobe interacties en verbreekt waterstofbruggen Guanidine-HCl werkt als ureum, maar sterker

22. Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) • Anionisch detergent, bij KT bewaren (koude precipiteert SDS!) • Geeft eiwit een negatieve lading • SDS ontvouwt eiwitten, maar denatureert ze niet volledig!

23. Detergentia

24. Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Hitte (5’, 95ºC) bevordert ontvouwing

25. Volledige eiwit denaturatie Opkoken van monster met ß-mercaptoëthanol of DTT: • dit zijn sterk reducerende stoffen, die zwavelbruggen verbreken • bevorderen oplosbaarheid eiwit • voorkomt aggregatie • analyse subeenheden mogelijk

26. Vraagje: Waarom worden detergentia gebruikt?

27. Na de homogenisatie? • Verder met centrifugeren • Uitzouten • Dialyseren • Kolomisolatie • Analyse middels SDS-PAGE of blot

28. Centrifugeren: waarom? • Verwijdering niet opgeloste stoffen • Scheiding deeltjes op grootte of dichtheid • Isolatie, zuivering en/of karakterisering biomoleculen

29. Centrifuge snelheid Hoe sneller de centrifuge draait Hoe hoger het aantal rounds per minute (rpm) Hoe sneller het water uit je was centrifugeert Hoe sneller je was droog is

30. Diameter centrifuge rotor Diameter beïnvloedt centrifuge proces Toename diameter Toename sedimentatiesnelheid bij gelijk aantal rpm

31. Centrifuge proces F = m·a a =2·r Snelheid van het deeltje, v =·r Versnelling van het deeltje, a = (2··n/60)2·r (Wilson & Walker: centrifugale veld, G) Toerental, n: aantal rounds per minute (rpm)

32. Relatie toerental / straal n: toerental in rpm r: straal in meter n2 = n1√(r1/r2) Hoe groter de straal, hoe lager het toerental om dezelfde sedimentatiesnelheid te krijgen. Bijvoorbeeld: bij een straal r1 = 50 mm en een straal r2 = 100 mm is toerental n1 = 1000 rpm en toerental n2 = 707 rpm

33. RCF... Relatieve centrifugale versnelling, RCF; het aantal malen g dat bereikt wordt. Hierin wordt de centrifugering vaak uitgedrukt. Hoe reken je dan om? Versnelling van het deeltje: a = (2··n/60)2·r = (2··n/60)2·r/9,81 (1 g = 9,81 m/s2)

34. RPM RCF RCF = 11,18·r·(n/1000)2 (Straal r is hier in centimeters) Nomogram

35. Centrifugeren als scheidingsmethode • Differentiële centrifugering of pelletering • Dichtheidsgradiënt centrifugering

36. Voorbeelden • Differentiële centrifugering of pelletering: • afdraaien van cellen uit je celkweek • DNA of RNA precipitatie met ethanol of isopropanol • Dichtheidsgradiënt centrifugering zonder gradiënt: • Fenol extractie • Bloed

37. CsCl gradiënt Scheiding van: • RNA van DNA • nucDNA van mtDNA (Isopycnisch: met gradiënt)

38. Rotoren Uitzwaai Vaste hoek Verticaal

39. Rotoren Vaste hoek vs. Uitzwaai (hoekrotor en “swingout”): snellere sedimentatie in hoekrotor Deeltjes bevinden zich verder van het middelpunt van de rotor

40. Rotorbalans: erg belangrijk! Bij grote centrifuges geldt: • Tarreren: • buizen, inclusief dop, met zelfde gewicht tegenover elkaar in de rotor • tot 0,1 g nauwkeurig • Vullen: buizen met dop minimaal voor 2/3e vullen, anders implosie gevaar! • Logboek bijhouden

41. Symmetrie • Vaste hoek rotor • Uitzwaai rotor 50 ml buizen

42. Symmetrie in uitzwaai rotor Goed! Fout! 10 ml buizen

43. In- en uitzouten • Eiwitten hebben beetje zout nodig om op te lossen: • Inzouten • Eiwitten slaan neer bij verhoging zoutconcentratie: • Uitzouten • Zoutconcentratie nodig voor eiwitprecipitatie, is voor elk eiwit anders

44. Zoutprecipitatie Fractionele precipitatie • Neerslaan eiwit door verhoging zoutconcentratie • Ammoniumsulfaat precipitatie ((NH4)2SO4) • Alle eiwitten reageren verschillend op verschillende concentraties zouten • kleinere eiwitten en eiwitten met meer geladen aminozuren lossen beter op • Afdraaien (centrifugeren) • Geprecipiteerd eiwit zit in pellet en overige eiwitten in supernatant

45. Zoutprecipitatie A280: Absorptie van eiwit bij 280 nm in spectrofotometer

46. Zoutprecipitatie Waar is het enzym en waar de overige eiwitten?

47. Dialyse Voor verwijdering van zout of kleine organische moleculen

48. Diffusie

49. Dialyse-membraan • Semipermeabel • Verschillende porie grootte (zowel in 1 membraan als tussen verschillende membranen) • Soms voorbehandeling nodig met NaHCO3 en EDTA • Vb. Cellulose

50. Ultrafiltratie Centricon Advantec