TD signalisation RN, lien avec le protéasome Objectif : Analyse des expériences

1. TD signalisation RN, lien avec le protéasome • Objectif : • Analyse des expériences • Rendre compte de votre analyse • Travail du fond et de la forme • Protocol : • Faire l’analyse de chaque figure • Rédiger cette analyse sur la copie • - Ramassage et redistribution des copies dans le groupe • Correction de chaque copie et notation de la copie • Redistribution des copies et correction de la correction

2. Zhang et al., EMBO journal, 2006 Les données de l’étude : . Les protéines SRC sont des coactivateurs des RE SRC : Steroid Receptor Coactivator Cette famille de protéines SRC est également désignée famille p160. Cette famille de protéines contient les membres suivants : -SRC1/NCoA1 -GRIP1/TIF2/SRC2/NCoA2 -pCIP/ACTR/AIB1/RAC3/TRAM1-SRC3/NCoA3 . LMP2 : sous unité du protéasome (Low Molecular mass Polypeptide 2) . Rpt6 : sous unité de la particule 19S du protéasome . Elongin : protéine impliquée dans la phase d’élongation de la transcription

3. Fig. 2. ECC-1 cells were transfected with an empty vector or an LMP2 expression vector. Seventy-two hours after transfection, cellular extracts were prepared and Western blotting analysis was carried out to analyze the expression of SRC-1, GRIP1, and AIB1. (B) LMP2 enhanced ER-mediated transcription. ECC-1 cells were transfected with cyclin D1 promoter-driven luciferase construct (cyclin D1-luc) or ERE-tk-luciferase (ERE-luc) reporter plasmid together with pcDNA3.1-LMP2 or pSUPER-LMP2-siRNA constructs. Forty-eight hours after transfection, cells were treated with 100 nM of E2 and reporter activity was measured. The firefly luciferase data for each sample were normalized to Renilla luciferase activity. (C) LMP2 enhanced the expression of endogenous ER target genes. The expression of ER target genes cyclin D1 and pS2 was measured by real-time RT–PCR in ECC-1 cells transfected with either LMP2 expression construct or LMP2 siRNA construct. Each bar represents the mean7s.d. for triplicate experiments. (D) Collaboration of LMP2 and SRC coactivators in enhancement of ER target transcription. ECC-1 cells were transfected with the ERE-luciferase reporter plasmid together with pcDNA3.1-LMP2 or SRC expression plasmids or pSUPER vector-based RNAi constructs. Forty-eight hours after transfection, cells were treated with 100 nM of E2 and the cells were harvested and firefly luciferase and Renilla activities were measured. Each bar represents the mean7s.d. for triplicate experiments. 3xp160 RNAi means transfection of a combination of three p160 RNAi constructs for silencing the expression of all SRC-1, GRIP1, and AIB1. (E) Western blotting analysis of the protein expression in ECC-1 cells that were transfected with the indicated plasmids. Fig. 1 Identification of LMP2 as an SRC-interacting protein.(A) Schematic representation of SRC proteins and their domains and deletions. (B) Yeast two-hybrid screening. (a) Negative control: cotransformation of yeast AH109 cells with pGBKT7-Lam and GADT7-T plasmids; (b) positive control: cotransformation of yeast AH109 cells with pGBKT7-53 and GADT7-T plasmids; (c) and (d) positive clones from the primary selection of mammary library using pGBKT7-SRC-1-N or pGBKT7-GRIP1-N, respectively; (e) and (f) confirmation of the interaction between LMP2 and SRC-1 or between LMP2 and GRIP1 by cotransformation of the yeast AH109 cells with isolated pACT2-LMP2 and pGBKT7-SRC-1-N or pGBKT7-GRIP1-N, respectively. (C) GST pull-down assays with 35S-labeled full-length SRC coactivators or their C- or N-terminal mutants and GST-LMP2 fusion protein. (D) Co-immunoprecipitation experiments. ECC-1 cells were grown in Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS) to 95% confluence and cellular nuclear extracts were prepared and immunoprecipitated with antibodies against LMP2. The immunoprecipitated materials were subjected to Western blotting analysis with antibodies against SRC-1, GRIP1, or AIB1. (E) GST pull-down assays with 35S-labeled full-length LMP2 and GST-ERa fusion protein. SRC-1 is included as a positive control.

4. Fig. 3 (A) A map of the pS2 gene showing the regions that were amplified by PCR in ChIP experiments. (B) The recruitment of LMP2, ERa, and SRC coactivators on promoter as well as on other regions of pS2 gene. EEC-1 cells were grown in the absence of estrogen for 3 days and treated with E2 for 45 min. The cells were then collected and ChIP experiments were performed with different primer pairs described in Materials and methods. (C) The size range of the DNA fragments used in ChIP experiments. (D) The recruitment of ERa, SRC-1, LMP2, Elongin A, and pol II on pS2 gene promoter. EEC-1 cells were grown in the absence of estrogen for 3 days and treated with E2 for 45 min. The cells were then collected and ChIP and ChIP Re-IP experiments were performed with primer a described in Materials and methods. Figure 4 The recruitment of LMP2, Elongin A, and pol II on pS2 gene. EEC-1 cells were grown in the absence of estrogen for 3 days and treated with E2 for 45 min. The cells were then collected and ChIP and ChIP Re-IP experiments were performed with different primer pairs described in Materials and methods.

5. Figure 6 The association of LMP2 with proteasome on pS2 gene. (A) Inhibition of ER-mediated transactivation by proteasome inhibitor MG132 in ECC-1 cells. ECC-1 cells were seeded in DMEM medium supplemented with 10% charcoal-dextran-stripped FBS and transfected with either vector or pcDNA3.1-LMP2 together with the reporter construct ERE-luc. Forty-eight hours after transfection, cells were treated with E2 in the absence or presence of proteasome inhibitor MG132 for 12 h and luciferase activities were assayed. Each bar represents the mean7s.d. for triplicate experiments. (B) Co-recruitment of LMP2 with Rpt6 and pol II on pS2 gene. ECC-1 cells were grown in phenol red-free DMEM medium supplemented with 10%charcoal-dextran-stripped FBS and transfected with the LMP2 siRNA construct. Forty-eight hours after transfection, the cells were left untreated or treated with 100 nM of E2 for 45 min. ChIP assays were performed using specific antibodies against Rpt6, pol II, and LMP2 and with primers for different regions of the pS2 gene. (C) Western blotting analysis of the expression of LMP2, Rpt6, and pol II. Fig. 5. The dynamic recruitment of ERa, SRC-1, LMP2, Elongin A, and pol II on pS2 gene. (A) EEC-1 cells were transfected with RNAi constructs to silence the expression of SRC-1, GRIP1, and AIB1 (3xp160 RNAi) or the expression of LMP2. Forty-eight hours after transfection, the cells were transfected again with a mouse LMP2 (mLMP2) expression construct. The cells then were switched to estrogen-depleted media for 3 days and treated with E2 for different periods of time. The cells were then collected at a 5-min interval and quantitative ChIP PCR was performed with primer a (for ERa, SRC-1, LMP2, and pol II) or primer b (for Elongin A). (B) Western blotting analysis of the protein expression in ECC-1 cells treated as above. (C) ECC-1 cells treated as above were transfected with ERE-luc reporter. After addition of E2 for 12 h, the cells were harvested and reporter activity was measured. The firefly luciferase data for each sample were normalized to Renilla luciferase activity.

6. - L’analyse des résultats de double hybride • (fig 1B) montre que les protéines SRC1-N • et GRIP1-N sont capables d’interagir avec • LMP2 dans un système cellulaire comme • la levure, en témoigne l’activation du gène • rapporteur obtenu dans les cellules • cotransfectées par les vecteurs • pACT2-LMP2 et pGBKT7-SRC1N ou • pACT2-LMP2 et pGBKT7-SRC1N. • - L’autoradiograhie présentée fig1C indique • que les protéines SRC-1, GRIP1, A/B1, • SRC-1-N,GRIP1-N, AIB1N interagissent • physiquement avec la protéine GST-LIMP2 • alors que ces mêmes protéines n’interagissent • pas avec la protéine GST. • De plus, les protéines SRC1-C, GRIP1-C et • A/B1-C ne sont liées ni par la protéine GST, ni • par la protéine GST-LIMP2. Cette expérience • indique que les protéines SRC-1, GRIP1, AIB1 • interagissent avec LMP2 via leur domaine • N-terminale. • - L’expérience de co-immunoprécipitation • réalisée dans les cellules ECC1 montre • que la protéine LMP2 est spécifiquement • précipitée par l’anticoprs aLMP2 (elle n’est • pas présente dans les extraits immunoprécipités • par l’anticorps control). Par ailleurs, • cette immunoprecipitation avec l’anticorps • aLMP2entraîne les protéines SRC-1 et GRIP1. • La dernière expérience de GST pull-down • montre que la protéine SRC-1 interagit • physiquement avec le récepteur aux estrogènes • alors que la protéine LMP2 n’en est pas capable. Note sur 4 -compréhension : 2 -clarté : 2

7. - La première expérience réalisée par WB • montre que l’expression des protéines SRC1, • GRIP1 et AIB1 n’est pas modifiée par l’expression • de la protéine LMP2. Seule la quantité de • protéine LMP2 augmente dans les cellules • transfectées par le vecteur permettant l’expression • de LMP2, comparé à la quantité de protéines • observées dans les cellules contrôles (transfectées • par le vecteur vide). Il n’y a pas d’action de LMP2 • sur l’expression des coactivateurs. • Les figures B et C montrent que l’E2 augmente • l’expression des vecteurs CyclinD1luc, EREluc • transfectés dans des cellules ECC-1. Par ailleurs, • une analyse par RT-PCRQ montre que la quantité • d’ARNm Cyclin D1 et pS2 endogène est également • augmentée après stimulation par E2 dans ces cellules. • Cette augmentation de la transcription des plasmides • ou de la quantité des ARNm endogènes est accrue • de manière significative lorsque les cellules expriment • la protéine LMP2. Cette augmentation est abolit en • présence de RNAi LMP2. • LMP2 augmente la transcription des gènes • estrogéno-dépendants. • La figure D montre que la quantité de luciferase • (produit du gène rapporteur) est plus importante dans • les cellules co-transfectées par le vecteur d’expression • LMP2 et les vecteurs exprimant les coactivateurs • SRC-1, GRIP1 et AIB1, démontrant une coopération • de ces protéines dans l’activation de la transcription • du gène rapporteur. • L’expérience de RNAi montre que lorsque les 3 membres • de la familles p160 sont ciblés, l’expression du plasmide est • inhibée. • -La figure E rend compte de la quantité de chaque protéine • SRC1, GRIP1, AIB1 et LMP2 dans les différentes conditions • expérimentales. Note sur 4 -compréhension : 2 -clarté : 2

8. LMP2 SRC1 polII AIB1 GRIP1 RE LMP2 a • - La figure A permet de positionner sur le gène • pS2 les régions amplifiées avec les différentes • amorces utilisées dans les expériences de ChIP. • La taille des fragments d’ADN est présentée dans • la figure C. • L’expérience de ChIP présentée figure B • montre que en présence d’E2, la région du • promoteur située entre -353 et -30 est • immunoprécipitée par tous les AC • utilisés, démontrant une proximité de ces facteurs • sur le promoteur du gène pS2 et une association • de ces protéines dans un même complexe. • De plus, d’autres régions du gène sont immuno- • précipités avec l’AC anti LMP2, démontrant que • la protéine se localise à différentes position du gène. • -La figure D montre que la région -353 -30 est • précipitée avec les AC anti RE, SRC1, LMP2, polII • mais pas avec l’AC anti elongin A. • La figure D présente également les résultats • d’une expérience de double IP. Les fragments • d’ADN sont immunoprécipités à l’aide d’un • premier AC, puis d’un deuxième AC. Après • une 1er immunoprecipitation avec un AC anti RE, • la région -353 -30 est immunoprécipitée avec les • AC anti SRC1,LMP2 et polII. • De même, après une immunoprecipitation avec un • AC anti SRC1, la région -353 -30 est immu- • noprécipitée avec les AC anti RE, LMP2 et polII. Note sur 3 -compréhension : 1,5 -clarté : 1,5 Rôle de LMP2 dans l’initiation de la transcription. Rôle de LMP2 dans la phase d’élongation?

9. Cette figure rend compte d’expériences de double ChIP réalisés à l’aide de différents anticorps. L’analyse de ces double ChIP montre que les protéines LMP2, polII et Elongin sont associées dans un même complexe. Ces résultats suggèrent que LMP2 joue également un rôle pendant l’élongation de la transcription. Note sur 3 -compréhension : 1,5 -clarté : 1,5

10. Note sur 3 -compréhension : 1,5 -clarté : 1,5 A. Cette figure montre le caractère cyclique du recrutement des protéines sur le promoteur. Ce recrutement cyclique des protéines ne se fait plus lorsqu’on empêche l’expression de LMP2 ou des protéines p160. Lorsqu’on bloque l’expression de LMP2, ces cycles de recrutement sont à nouveau possible si on exprime un peu plus tard la protéine LMP2. B. Ces western blot témoignent de la quantité des protéines étudiées en ChIP. C. Cette expérience montre l’augmentation de la transcription d’un vecteur rapporteur estrogénodépendant en présence de protéine LMP2. Le recrutement des co-activateurs sur le promoteur et l’activation de la transcription nécessite la protéine LMP2.

11. Note sur 3 -compréhension : 1,5 -clarté : 1,5 A. L’activation de la transcription médiée par E2 + LMP2 est abolit en présence d’inhibiteur du protéasome MG132. Le rôle de LMP2 sur l’activation de la transcription médiée par E2 nécéssite l’activité du protéasome. B. Pour confirmer ce résultat, les auteurs vérifient qu’une autre sous unité du protéasome (Rpt6) est impliquée dans le processus. Ils montrent par ChIP que la protéine Rpt6 est recrutée avec la polII sur la totalité du gène pS2 après stimulation par E2.