第十五章生物技术应用

第十五章生物技术应用 第一节细胞和组织培养第二节植物原生质体培养和体细胞杂交第三节重组DNA技术（基因工程）第四节分子标记辅助选择技术第五节分子设计育种

本章教学目标 通过本章学习，了解生物技术在作物育种中的意义及重要作用，生物技术的领域，在育种中应用的基本方法和育种程序。

第一节细胞和组织培养的应用 植物组织培养介绍一体细胞变异体和突变体的筛选二离体培养技术在植物育种中的应用三细胞和组织培养技术的其他利用途径

植物组织培养 • 组织培养（tissue culture，in vitro culture）指把植物的个别组织或细胞放在培养基上，人工诱导其形成植株的方法和技术。是一种植物无菌培养技术。包括： • 胚胎培养 • 器官培养 • 愈伤组织培养 • 液体培养（悬浮培养）

植物组织培养的选材： • 体细胞如根、茎、叶的分生组织； • 生殖细胞如花粉

植物组织培养

一体细胞变异体和突变体 1. 基本概念 2. 通过组织培养获得变异体或突变体的方法 3. 体细胞无性系选择工作中的几个问题

1. 基本概念 植物体细胞在离体条件下，会发生各种遗传和不遗传的变异。无性系变异（somaclonal variation）：指植物体细胞在离体条件下所发生的各种变异。变异体（varient）：指不加任何选择压力而筛选出的变异个体；突变体（mutant）：指经过施加某种选择压力所筛选出的无性系变异；培养基中的毒素、盐分等

无性系变异的筛选与个体水平上的诱变育种相比，有以下优点：无性系变异的筛选与个体水平上的诱变育种相比，有以下优点： • 变异频率高，稳定快； • 变异的筛选可以在实验室内有控制地进行，节省人力和物力； • 选择效率高。 • 成功的例子：耐盐碱的烟草，耐低温的水稻；花培品种很多……

2. 组织培养获得变异体或突变体的方法 如何通过组培获得突变体：组培前，组培中，组培后（1）. 组织培养之前的变异及其选择：体细胞变异---分离---组培---再生为植株。以烟草抗除草剂的变异体筛选为例，说明其选择过程：

烟草花药愈伤组织 灭草松、甲二威灵，便于选择单倍体植株 r射线照射，诱导其变异；除草剂处理幼叶,观察其反应大部分变黄，少量组织保持绿色取绿色组织培养，诱导再生再生植株染色体加倍纯合二倍体抗除草剂材料

2. 组织培养获得变异体或突变体的方法 对15株抗灭草松的突变体中的8株进行遗传鉴定，它们与敏感型植株杂交的F1都是敏感型的，说明抗性是一个隐性性状。进一步分析证明，这8个抗性植株中包含有4个不同的抗性基因，F2的分离方式有两种，一种是3（敏感）：1（抗）；另一种是15（敏感）：1（抗）；表明后一种植株中有两个基因发生了突变。

（2）组织培养期间的变异及其选择：指在组培过程中对培养物（愈伤组织）施加某种处理，使之发生变异后再进行选择。这种方法往往能收到比较好的效果。（2）组织培养期间的变异及其选择：指在组培过程中对培养物（愈伤组织）施加某种处理，使之发生变异后再进行选择。这种方法往往能收到比较好的效果。 2. 组织培养获得变异体或突变体的方法

玉米抗小斑病的T小种突变体的筛选过程： Gengenbach,B.G.（1975）用玉米小斑病的T小种毒素在感病的玉米培养物中进行筛选，经过愈伤组织培养以及毒素的继代培养，最后获得了抗性愈伤组织并诱导出再生植株。过程：感小斑病的幼培----愈伤组织----加毒素----抗性愈伤组织----再生植株----抗小斑病 2. 组织培养获得变异体或突变体的方法

玉米抗小斑病T小种的筛选结果（Gengenbach,B.G,1975）玉米抗小斑病T小种的筛选结果（Gengenbach,B.G,1975）

（3）组织培养后的选择和鉴定：指对组培后的植株的一些变异进行选择、利用的方法。（3）组织培养后的选择和鉴定：指对组培后的植株的一些变异进行选择、利用的方法。原理：诱变剂的继续作用主要是形态性状，如株型、叶色等；这种选择方式中所用的培养基一般不包含特定的选择因素，但往往包含诱变剂，由此产生的变异植株可能出现某种有益的变异，将再生植株种在田间或温室内进行选择。这种选择多局限于形态性状，如株型、叶色以及其他可见的性状。 2. 组织培养获得变异体或突变体的方法

3. 体细胞无性系选择中应注意的问题 （1）选择目标的确定（选择前的准备工作）：主要考虑三个因素： ① 性状的意义，如抗逆性，品质等； ② 目标性状基因的数目；单基因易于识别；多基因难识别； ③ 考虑该性状的显隐性；显性的当代表现，隐性的下代表现

3. 体细胞无性系选择的问题 （2）外植体的选择：外植体（explant）是指用来进行培养的植物体某一部分组织的统称。选择外植体要考虑： ① 基因型；选易于组培的品种 ② 植物的合适部位；分生组织 ③ 考虑它的合适年龄；玉米幼胚10～11天

（3）培养系统的选择： 器官发生系统--再生植株由愈伤组织直接分化而成）；胚胎发生系统---外植体首先形成愈伤组织，再由愈伤组织分化出来类似于种子胚的胚状体（embryoid），胚状体进一步发育成熟而形成完整植株 3. 体细胞无性系选择的问题

（4）无性系变异的选择：无性系变异通常在愈伤组织阶段就有所表现，但是它在再生植株中却有可能不再出现，而且并非出现在植株上的变异都能遗传，因此必须选择到目标性状稳定才算成功。（4）无性系变异的选择：无性系变异通常在愈伤组织阶段就有所表现，但是它在再生植株中却有可能不再出现，而且并非出现在植株上的变异都能遗传，因此必须选择到目标性状稳定才算成功。 3. 体细胞无性系选择的问题

通常具有目标性状的无性系变异植株往往同时具有并发的其他不良的变异。解决这类问题的办法有二：通常具有目标性状的无性系变异植株往往同时具有并发的其他不良的变异。解决这类问题的办法有二：一是在大量无性系中筛选具有尽可能少的并发变异的个体；其次是选用两个都具有目标性状的无性系杂交，从他们的后代中筛选没有不良变异的重组体。 3. 体细胞无性系选择的问题

二离体培养技术的应用 （1）胚珠或子房培养与试管受精（2）离体胚的培养在育种中的应用

（1）胚珠或子房培养及试管受精 克服远缘杂交不亲和性的有效方法，1967年Zenkteler 采用试管受精法，克服了石竹科内远缘杂交的不亲和性。他在异株女蒌菜和红色女蒌菜的种间杂交中和异株女蒌菜的属间杂交中，采用离体培养子房、人工授精的方式，使受精过程正常进行，并发育成良好的胚，取出胚进行离体培养，获得了开花的F1株。

（2）离体胚的培养的应用 1. 使远缘杂种的胚发育成植株： 1925年Laibach首先在亚麻属的中间杂种中采用了这一方法， 1991年李浚明等用普通小麦品种农大146作母本，簇毛麦作父本，经有性杂交和杂种未成熟胚培养，成功地获得了杂种植株；

（2）离体胚的培养的应用 2. 促进核果类植物胚的后熟作用：早熟品种与晚熟品种杂交，很难得到杂交后代.用幼胚离体培养就能得到杂交后代，因此在核果类早熟性育种中常采用这种方法； 3. 打破种子的休眠期；用离体胚培养法，几天就可长成幼苗，大大缩短了育种年限。

三细胞和组织培养的其他用途 （1）快速繁殖（2）种质保存（3）产生无病毒植物材料

（1）快速繁殖 通过分生组织的培养，可以快速繁殖有经济价值的植物，如花卉、药材等，有些植物应用次法，一年可以产生106~107个植株。如广西用此法繁殖甘蔗苗比常规法效率高1000倍以上。由此法产生的植株一般都整齐一致，尤其是对特别宝贵的基因型，用此法扩繁更有意义。方法有愈伤组织培养和丛芽培养等。

（2）种质保存 有些植物种质的保存已经正式采用组培方法，荷兰的所有甜菜种质都是用此法保存的，当然这并不意味着不再应用种子。

（3）产生无病毒植物材料 通过茎尖培养可以淘汰病毒，还可能淘汰某些细菌，这对于营养繁殖的植物是非常重要的。目前国内很多植物都是通过这种手段脱毒，由此而得到的后代可以大大提高产量。

（4）花药培养 通过花药培养进行单倍体育种。

第二节植物原生质体培养和体细胞杂交 原生质体简介一原生质体的分离和培养二原生质体的融合三杂种细胞的鉴别和选择四诱导杂种细胞产生愈伤组织和再生植株

基本概念 1. 原生质体 2. 原生质体培养利用途径 3. 体细胞杂交 4. 体细胞杂交的特点及其环节

1. 原生质体 原生质体：指用特殊方法脱去细胞壁的、裸露的、有生活力的原生质团。就单个细胞而言，除了没有细胞壁外，它具有活细胞的一切特征。

2. 原生质体培养的利用途径 ① 通过原生质体培养可以制造单细胞无性系。 ② 原生质体可以作为基因转化的受体，使之接受外源遗传物质（如细胞器、染色体或DNA片段等）产生新的变异类型。 ③ 利用原生质体进行许多基础性研究，如细胞生理、基因调控、分化和发育等。 ④细胞融合

3. 体细胞杂交 体细胞杂交（somatic hybridizatioin）又称原生质融合（protoplast fussion），是指两个具有完整遗传物质的体细胞之间的融合。结果是合子中包含双亲体细胞中全部的染色体及全部的细胞质。

体细胞杂交 × A A B B AB AB

4. 体细胞杂交的特点 最大特点是：有可能使有性杂交不亲和的双亲之间杂交成功。也就是说在体细胞水平上的杂交，其双亲间的亲和性或相容性似乎有所提高，因而有可能扩大杂交亲本和植物资源的利用范围。

4. 体细胞杂交的环节 主要有： ① 原生质体的分离和培养； ② 原生质体间的融合（体细胞杂交）； ③ 融合后杂种细胞的鉴定与选择； ④ 诱导杂种细胞产生愈伤组织和再生植株。

一原生质体的分离和培养 1. 一般用愈伤组织或叶肉细胞等分生能力强的细胞分离原生质体。

2. 改良或选用合适的培养基和培养方法，用于培养原生质体的培养基和培养方法很多，其中KM8P及其改良培养基效果较好，如果采用琼脂糖包埋或琼脂糖珠、看护培养、饲养培养等方法能大幅度提高培养效果。一原生质体的分离和培养

3. 选择适宜的酶制剂，近年来由于使用了Onzuka R-10和Onzuka Rs纤维素酶以及Pectolyase果胶酶，大大提高了禾谷类植物原生质体的游离效果，又保证了原生质的质量。一原生质体的分离和培养

原生质体分离的示意图 去下表皮培养18h 叶片小块飘浮在加渗透稳定剂的酶液中叶片表面消毒再悬浮于蔗糖洗涤培养基中离心除去酶液离心再悬浮培养再悬浮培养以获得合适的植板密度

二原生质体的融合 关键是：融合剂的选用，早期用0.25 mol/L 的NaNO3和高Ca2+作融合剂；后来改用PH溶液处理，可大大提高融合率。其特点是：处理量大、频率高、不影响再生而又不需昂贵的设备；其缺点是：处理时间过长，有时不易掌握，有时形成多元原生质体融合体。

二原生质体的融合 近年来又研究出一种电融合技术，先在交流电场下形成原生质体凝聚体，然后用直流电脉冲刺激，使膜发生融合。

三杂种细胞的鉴别和选择 （1）用选择性培养基创造条件（2）互补选择法在两亲细胞融合试验中，可以产生同源融合体（A×A或B×B）、异源（A×B）和非融合体（A或B）。如何选择出异源融合体即杂种细胞：（3）异核体机械分离和核型分析（4）体细胞杂种核胞质杂种鉴定

（1）用选择性培养基创造条件 用选择性培养基创造专门使杂种细胞才能生长的条件：卡尔逊（Carlson, 1972）育成的世界上第一个烟草体细胞杂种就是采用这种方法，已知两亲的原生质体均不能在无外源激素的培养基上分裂，而通过有性杂交得到的双二倍体的原生质体却能在无外源激素的培养基上分裂并长成愈伤组织

（2）互补选择法 这种方法是用可察觉的标记性状的互补进行选择，常常涉及到某些叶绿体突变和生化突变的利用：如在矮牵牛体细胞杂交中，一个亲本具有亚致死因子S，其外部特征为生活力弱。另一亲本具有黄绿苗因子V，纯合的VV个体表现黄绿苗。S和V处于不同位点上，当两种原生质体融合后，由杂种细胞再生成的植株（V+S）表现绿色、生长健旺；而非杂种细胞再生的植株则分别具有两亲的性状。此外，体细胞杂种植株的有性繁后代，又能分离出亚致死（S）、绿色健旺（S+V）和黄绿苗（V）三类植株。

（3）异核体机械分离和核型分析 异核体机械分离和杂种细胞的核型分析：采用特制的培养皿，把一个个细胞单独分离开来悬滴培养，然后再用鉴别核型的方法筛选杂种细胞。

（4）体细胞杂种和胞质杂种的鉴别 前已述及胞质杂种与体细胞杂种在核的组成上往往有明显区别，这种差别通常用以下方法才能鉴别： ① 花部和营养体的形态观察； ② 细胞学监测； ③ 生化鉴定； ④ 分子生物学分析；

第十五章 生物技术应用