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ANALISI ENZIMATICA

ANALISI ENZIMATICA. L’analisi enzimatica comprende tre tipi principali di applicazioni: determinazione dell’ attività catalitica di enzimi determinazione della concentrazione di sostanze per mezzo di enzimi

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ANALISI ENZIMATICA

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  1. ANALISI ENZIMATICA L’analisi enzimatica comprende tre tipi principali di applicazioni: • determinazione dell’ attività catalitica di enzimi • determinazione della concentrazione di sostanze per mezzo di enzimi • determinazione della concentrazione di sostanze mediante reattivi marcati con enzimi

  2. Reazione catalizzata DG* Reazione non catalizzata G DG* X Y DG ENZIMI • Gli Enzimi sono macromolecole biologiche di natura proteica con gruppi funzionali sui quali hanno luogo scambi o trasformazioni di sostanze. • Gli Enzimi sono catalizzatori biologici. Gli Enzimi non modificano l’equilibrio di una reazione, ma aumentano la velocità con cui l’equilibrio viene raggiunto.

  3. REVERSIBILITA’ DELLE REAZIONI ENZIMATICHE • L’enzima favorisce il raggiungimento dell’equilibrio, quindi catalizza anche la reazione inversa • A <====> B • Ma, se B è substrato di una reazione successiva, la prima reazione diventa praticamente irreversibile • A -----> B <====> C • Ciò vale per catene anche molto lunghe di reazioni (catene enzimatiche)

  4. ENZIMI • Gli Enzimi differiscono dai catalizzatori chimici per: • Le velocità delle reazioni catalizzate da enzimi sono generalmente da 106 a 1012 più veloci di quelle non catalizzate. • Gli Enzimi catalizzano reazioni in condizioni relativamente blande, condizioni fisiologiche. • Gli Enzimi spesso hanno un’elevata specificità verso substrati e prodotti. • L’attività degli Enzimi può essere regolata da altri fattori oltre che da substrato e prodotti.

  5. Enzimi (“nel lievito”): un po’ di storia... • 1835: prima teoria della catalisi chimica (Jöns Jacob Berzelius, chimico svedese) • 1836: estrazione dal succo gastrico della pepsina • 1860: fermentazione causata da sostanze termolabili (Louis Pasteur, microbilogo francese) • 1877: primo uso del termine enzima • 1897: estrazione dal lievito degli enzimi che catalizzano la fermentazione alcoolica; fermentazione in assenza in assenza di (Eduard Buchner, tedesco, premio Nobel per la chimica) - enzimologia • 1894: Fischer propose il modello “lock and key” per descrivere la specifictà enzimatica • 1926: cristallizzazione dell’ureasi (James Sumner, chimico americano) • 1930: cristallizzazione di pepsina, tripsina e chimotripsina: tutti gli enzimi sono proteine (John Howard Northrop, americano, premio Nobel per la chimica) • 1960: teoria dell’allosterismo (François Jacob, Jacques Monod, francesi, premio Nobel per la Medicina , Jan Pierre Changeaux, genetista francese)

  6. CARATTERISTICHE DEGLI ENZIMI • OTTIMIZZARE LA RESA: • Svolgere solo le reazioni necessarie • Impedire reazioni indesiderate (specificità di substrato) • Portare a termine le reazioni in tempi brevi • Indipendenza dall’ambiente (temperatura, pressione) • Riutilizzo della stessa “macchina” per molte volte • MINIMIZZARE GLI SPRECHI: • Non produrre sottoprodotti (specificità di reazione) • Minimizzare il dispendio energetico

  7. coenzima gruppo prostetico (legato covalentemente) ione metallico OLOENZIMA STRUTTURA DEGLI ENZIMI • Alcuni enzimi sono delle oloproteine, costituiti solo da amminoacidi • Altri enzimi sono eteroproteine: costituiti da una parte proteica (apoenzima) e parte non proteica (cofattori) APOENZIMA (Parte proteica)

  8. COFATTORI: COENZIMI Nicotinamide Adenina Dinucleotide (NAD+) • Coenzima di deidrogenasi • lattato + NAD+ piruvato + NADH + H+ • Esiste una forma fosforilata NADP+

  9. COFATTORI: COENZIMI Adenosin trifosfato (ATP) • Coenzima delle chinasi • Esempio: Glucosio + ATP  Glucosio-6-fosfato + AD

  10. COFATTORI VITAMINE: precursori di coenzimi

  11. COFATTORI COFATTORI METALLICI: Elementi alcalini (Na+ K+) Alcalino terrosi (Ca++,Mg++) Elementi bivalenti (Zn++,Mn++ ) GRUPPI PROSTETICI: FMN, FAD eme

  12. COFATTORI Flavina adenina dinucleotide (FAD) • Coenzima di deidrogenasi • Derivato da riboflavina (vit. B6) • Trasferisce due protoni da/a substrati • Esempio: Succinato + FAD  Fumarato + FADH2

  13. SPECIFICITA’ DI SUBSTRATO Una delle caratteristiche principali degli enzimi è la specificità verso il substrato Gli enzimi sono altamente specifici sia nel legare molecole chirali che nel catalizzare le loro reazioni.

  14. NOMENCLATURA • Ogni Enzima è identificato con un nome comune ed un nome sistematico • Il nome sistematico consiste nel nome del substrato seguito dalla parola terminante in –asi che indica la reazione specifica • Gli enzimi sono stati divisi in 6 classi in base alla chimica della reazione che catalizzano • ossidoreduttasi • transferasi • idrolasi • liasi • isomerasi • ligasi

  15. Classificazione Internazionale Enzimi • Dalla Commissione Internazionale per la nomenclatura e la • classificazione degli enzimi è stato adottato un sistema di • identificazione che fa uso di un codice a 4 cifre: • I cifra corrisponde alla classe dell’enzima • II cifra corrisponde alla sottoclasse • III cifra indica la sottoclasse di appartenenza dell’enzima • IV cifra specifica ulteriormente l’enzima in rapporto al tipo di • substrato che viene trasformato dall’enzima

  16. Classificazione Internazionale Enzimi • 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione • 1.1 agisce sul gruppo CHOH del donatore • 1.2 agisce sul gruppo aldeidico o chetonico del donatore • 1.3 agisce sul gruppo CH-CH del donatore • 1.4 agisce sul gruppo CH-NH2 del donatore • 1.5 agisce sul gruppo C-NH del donatore • 1.6 agisce su NADH o NADPH. • 1.7 agisce su altri composti azotati • 1.8 agisce su gruppi solforati • 1.9 agisce sui gruppi eme

  17. Classificazione Internazionale Enzimi • 1 - ossidoreduttasi: reazioni di ossido-riduzione • 2 - trasferasi: trasferimento di gruppi chimici da una molecola ad un'altra • 2.1 gruppi ad una unità di carbonio • 2.2 gruppi chetonici o aldeidici • 2.3 gruppi acilici • 2.4 gruppi glicosidici • 2.5 gruppi alchilici • 2.6 gruppi azotati • 2.7 gruppi fosforici • 2.8 gruppi contenenti zolfo

  18. Classificazione Internazionale Enzimi • 1 - ossidoreduttasi: • 2 - trasferasi • 3 - idrolasi: reazioni di idrolisi • 3.1 legami esterei: esterasi 3.1.1. idrolasi esteri carbossilici 3.1.3. idrolasi monoesteri fosforici • 3.2 legami glicosidici: glicosidasi • 3.3 altri legami • 3.4 legami peptidici • 3.5 legami C-N non peptidici • 3.6 legami anidridici • 3.7 legami C-C

  19. Classificazione Internazionale Enzimi • 1 - ossidoreduttasi • 2 - trasferasi • 3 - idrolasi • 4 - liasi: reazioni di addizione a doppi legami • 4.1 legami C = C • 4.2 legami C = O • 4.3 legami C = N • 4.4 legami C = S

  20. Classificazione Internazionale Enzimi • 1 - ossidoreduttasi • 2 - trasferasi • 3 - idrolasi • 4 - liasi • 5 - isomerasi: reazioni di trasformazione di una molecola nel suo isomero • 5.1 racemasi • 5.2 cis-trans isomerasi

  21. Classificazione Internazionale Enzimi • 1 - ossidoreduttasi • 2 - transferasi • 3 - idrolasi • 4 - liasi • 5 - isomerasi • 6 - ligasi: reazioni di formazione di nuovi legami (con rottura di ATP in AMP e pirofosfato o ADP e Pi) • 6.1 legami C-O • 6.2 legami C-S • 6.3 legami C-N • 6.4 legami C-C

  22. NOMENCLATURA Esempi: ATP + Creatina<-------> creatina-fosfato + ADP ATP : Creatinafosfotrasferasi EC 2.7.3.2 Alcool+NAD+<-------> aldeide (o chetone) + NADH Alcool: NAD+ossidoreduttasi EC 1.1.1.1

  23. NOMENCLATURA

  24. UNITÀ DI MISURA • Un enzima può essere misurato in termini di concentrazione come qualunque altra proteina • Da un punto di vista analitico interessa invece la misura dell’attività catalitica (o attività enzimatica) che si esprime in Unità Internazionali (U.I.) ed è definita come:Una unità di attività enzimatica è definita come la quantità di enzima in grado di catalizzare la trasformazione di una micromole di substrato in condizioni standardizzate. • Si definisce inoltre costante catalitica onumero di turnover l’attività enzimatica per mole di enzima. • Si definisce la specificità di un enzima l’attività enzimatica per mg di proteina (espressione di purezza di una preparazione).

  25. CONCENTRAZIONE CATALITICA • Nel 1972 la commissione per la nomenclatura degli enzimi e la Federazione Nazionale di Chimica Clinica (IFCC) introducono l’unità katal (kat)che misura la velocità di reazione in mols-1 • L’unità di misura fu aggiunta all’International System al “21th General Conference of Weights and Measures” nel 1999. • Per un dato metodo analitico vale la relazione: • 1 U = 1 mmol/min = 10-6 mol/min = 16.67 nmol/s  16.67 nKat

  26. G6125 Glucose  Oxidase Aspergillus nigerType II 15,000-25,000 units/g solid (without added oxygen) Synonyms b-D-Glucose: oxygen 1-oxidoreductase GOx G.Od. CAS Number 9001-37-0 Enzyme Commission (EC) Number 1.1.3.4 EG/EC Number EINECS Properties MDL number MFCD00131182 References Safety Information Analysis Note Protein determined by Biuret method. Caution Some loss of activity may occur after more than 3 days at room temperature. This product may be shipped with or without dry ice. Linkage This preparation is formulated from Type VII, G 2133, by addition of potassium gluconate. Unit Definition One unit will oxidize 1.0µmole ofb-D-glucose toD-gluconolactone and H2O2per min at pH 5.1 at 35° C, equivalent to an O2uptake of 22.4µl per min. If the reaction mixture is saturated with oxygen, the activity may increase by up to 100%. storage temp. -20°C foreign activity Catalase£2 Sigma units/mg solid foreign activity amylase, invertase and glycogenase, and maltase and galactose oxidase ~2 % Merck Merck13, 4473 Hazard Codes Xn Risk Statements 42 Safety Statements 22-45 RTECS RQ8452000

  27. P6782 Peroxidase horseradishType VI-A ~1000 units/mg solid (using ABTS) 250-330 units/mg solid (using pyrogallol) essentially salt-free, lyophilized powder Synonyms Horseradish peroxidase Donor: hydrogen-peroxide oxidoreductase CAS Number 9003-99-0 Enzyme Commission (EC) Number 1.11.1.7 EG/EC Number 2326686 MDL number MFCD00071339 Description Analysis Note This product is assayed using ABTS for easy comparison to other suppliers'unit: approx. 1,000 units per mg solid Linkage Similar to P8375 Packaging Packaged in mg solid Unit Definition One ABTS unit will oxidize 1µmole of ABTS per minute at 25°C at pH 5.0 Analysis Note Using 2,2'-azinobis(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid) (ABTS) tablets (Prod. No. A 9941) as substrate, approx. four times the activity is observed. Analysis Note The RZ ( Reinheitszahl) is the absorbance ratio A403/A275determined at 0.5-1.0 mg/ml in deionized water. It is a measure of hemin content, not enzymatic activity. Even preparations with high RZ may have low enzymatic activity. Unit Definition One unit will form 1.0 mg purpurogallin from pyrogallol in 20 sec at pH 6.0 at 20°C, unless otherwise indicated in the listing. This purpurogallin (20 sec) unit is equivalent to approx. 18µM units per min at 25°C.

  28. Related Products Related Products SubstrateA0156N-(4-Aminobutyl)-N-ethylisoluminol minimum 90 % SubstrateA1661 N-(6-Aminohexyl)-N-ethylisoluminol SubstrateA1888 2,2'-Azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid) diammonium salt ~ 98 % TLC SubstrateA3537 5-Aminosalicylic acid ~ 99 % SubstrateA4382 4-Aminoantipyrine Reagent Grade SubstrateA4685 Luminol sodium salt SubstrateA5754 3-Amino-9-ethylcarbazole ~ 90 % SubstrateA8264 4-Aminophthalhydrazide monohydrate SubstrateA8511 Luminol minimum 97 % HPLC SubstrateD5907 Dicarboxidine dihydrochloride SubstrateD9143o-Dianisidine SubstrateG5502 Guaiacol SubstrateH6386 3-(4-Hydroxyphenyl)propionic acid SubstrateP2923 Pyrogallol ACS Reagent InhibitorQ0125 Quercetin dihydrate minimum 98 % HPLC, Powder InhibitorS2002 Sodium azide Reagent Plus,>= 99.5 %

  29. C5421 Cholesterol Oxidase from Cellulomonas sp.buffered aqueous solution 20-60 units/mg protein (biuret) Synonyms Cholesterol: oxygen oxidoreductase CAS Number 9028-76-6 Enzyme Commission (EC) Number 1.1.3.6 MDL number MFCD00130783 Identifiers Unit Definition One unit will convert 1.0µmole of cholesterol to 4-cholesten-3-one per min at pH 7.5 at 25 °C. Note: 4-cholesten-3-one may undergo isomerization. Physical form Solution in 10 mM Tris-HCl, pH 8.0 Description storage temp. -20°C Properties References Literature Smith, A.G. and Brooks, C.J.W.,Biochem. Soc. Trans. 5, 1088 (1977)

  30. Glucose  Dehydrogenase Bacillus megateriumBioChemika ~33 units/mg Synonyms b-D-Glucose: NAD[P]+1-oxidoreductase CAS Number 9028-53-9 Enzyme Commission (EC) Number 1.1.1.47 EG/EC Number 2328369 MDL number MFCD00131181 Miscellaneous NADH-regenerating enzyme. Valine manufacture from ketoisovalerate Unit Definition 1 U corresponds to the amount of enzyme which will oxidize 1µmolb-D-glucose to D-glucono-d-lactone per minute at pH 7.6 and 25°C mol wt Mr~120000 storage temp. -20°C Literature A. Honorat-Pascal et al.,Appl. Microbiol. Biotechnol. 34, 236 (1990) 49165 Identifiers Description Properties References

  31. SITO ATTIVO sito di legame SITO ATTIVO sito catalitico lisozima

  32. SITO ATTIVO • Sito catalitico:sito dove avviene la reazione • Sito di legame: • - zona dove il substrato si lega - il substrato si lega all’enzima con interazioni deboli • - la forma è complementare al substrato • - sono cavità o fenditure

  33. PASSAGGI DI UNA REAZIONE ENZIMATICA • Inizialmente si forma il • complesso enzima (E)/substrato (S) • Il complesso ES va verso lo stato di • transizione • Si forma un complesso tra enzima (E) e prodotto (P) • E e P si separano • Tutti questi passaggi sono equilibri

  34. PASSAGGI DI UNA REAZIONE ENZIMATICA

  35. PASSAGGI DI UNA REAZIONE ENZIMATICA Formazione del complesso ES

  36. PASSAGGI DI UNA REAZIONE ENZIMATICA Formazione dello stato di transizione ES*

  37. PASSAGGI DI UNA REAZIONE ENZIMATICA Formazione del complesso EP

  38. PASSAGGI DI UNA REAZIONE ENZIMATICA Formazione del prodotto P

  39. CARATTERISTICHE DEL SITO ATTIVO • “Lock and key model” • - proposto da Emil Fischer nel 1890 • - solo il substrato con la forma appropriata si adatta • al sito attivo • “Induced-fit model” • - proposto da Daniel Koshland nel 1958 • - la forma del sito attivo cambia profondamente quando • si lega il substrato

  40. “Lock and key model” Esempio: proteasi

  41. “Induced- fit model” Esempio: esochinasi

  42. ISOENZIMI • Gli enzimi non hanno una struttura omogenea Isoenzimi: proteine che catalizzano la stessa reazione e presentano diverse proprietà molecolari (diversa carica elettrica, diversa solubilità, diversa resistenza ad agenti chimici e fisici) e/o diverse proprietà funzionali presentano differenze in termini di pH ottimale, affinità per substrato e coenzima….. Es. Isoenzimi della lattato deidrogenasi LDH: LDH1 4 subunità H LDH2 3 subunità H e da una M (H3M) (miocardio, eritrociti, rene e polmone) LDH3 (H2M2) (milza, pancreas, tiroide, linfonodi) LDH4 (HM3) LDH5 (M4) (fegato e muscoli scheletrici)

  43. stato di transizione energia libera di attivazione della reazione inversa (non catalizzata) energia libera di attivazione della reazione in avanti (non catalizzata) energia libera di attivazione della reazione inversa (catalizzata) energia libera stato iniziale cambiamento totale di energia libera durante la reazione energia libera di attivazione della reazione in avanti (catalizzata) stato finale direzione della reazione ENERGIA LIBERA DI ATTIVAZIONE • L’energia libera di attivazione DG è la quantità di energia necessaria per portare tutte le molecole di 1 mole di una sostanza, ad una data temperatura, allo stato di transizione • Gli enzimi esercitano la loro attività catalitica abbassando l’energia libera di attivazione • Di conseguenza, in presenza di enzima sarà maggiore la concentrazione della specie allo stato di transizione • La velocità di reazione è proporzionale alla concentrazione della specie allo stato di transizione • Quindi, gli enzimi esercitano la loro attività catalitica aumentando la velocità delle reazioni chimiche

  44. CATALISI ENZIMATICA • Gli enzimi: • abbassano la barriera dell’energia di attivazione inserendo stati di transizione più bassi • stabilizzano lo stato di transizione

  45. ATTIVITÀENZIMATICA • L’attività di un enzima viene misurata come velocità della reazione da esso catalizzata • La velocità di reazione viene misurata in termini di quantità di substrato trasformato, o di prodotto che si forma, nell’unità di tempo • La velocità delle reazioni chimiche è soggetta a leggi chimico-fisiche ben definite che consentono di ricavare delle equazioni della velocità diverse a seconda del tipo di reazione • Queste equazioni mettono in relazione la velocità di reazione con la concentrazione dei reagenti

  46. Cinetiche chimiche (AP) Concentrazione di prodotto Vt V iniziale Tempo Equilibrio k=costante di velocità n=numero intero 1-3

  47. Cinetiche chimiche (AP) Conc. di prodotto Velocità Conc. di substrato V iniziale V finale Tempo Tempo Tempo

  48. A P A + B P 2 A P CINETICA CHIMICA • Le reazioni chimiche vengono classificate su base cinetica per mezzo dell’ordine di reazione • L’ordine di reazione indica come la velocità di reazione dipende dalla concentrazione dei reagenti • Reazioni di 1° ordine • Reazioni di 2° ordine • Reazioni di ordine 0 • La velocità di reazione nondipende dalla concentrazione dei reagenti

  49. [prodotto] Velocità iniziale A4 A3 A2 A1 Tempo A1 A2 A3 A4 [A] Effetto della concentrazione di A (A  P) A4 > A3 > A2 > A1

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