实验七应用 PCR-RFLP 进行 ABO 血型分型

实验七应用PCR-RFLP进行ABO血型分型 一、实验目的学习RFLP分子标记的特点及应用；学习应用PCR-RFLP进行ABO血型分型的原理和方法。

二、实验原理 1. RFLP (restriction fragment length polymorphism)限制性片段长度多态性 DNA 序列中的某个碱基的差异，使所在位点的DNA 序列产生（或缺失）某种限制性内切酶的位点。这样，利用该限制性内切酶消化此DNA时，便会产生不同长度的限制性片段。因此，在同种生物的不同个体中会出现不同长度的限制性片段类型，即限制性片段多态性。

In a RFLP, alleles may differ in the presence or absence of a cleavage site in the DNA. In this example, the aallele lacks a restriction site that is present in the DNA of the A allele. RFLP alleles are codominant（共显性）

2. ABO血型基因型检测的原理 ABO血型是人类发现的第一个血型系统 ,作为一种遗传标记，是研究人类种族起源、亲缘关系的一个重要指标，在临床输血、法医物证检验等领域也有着重要意义。 ABO血型鉴定可采用血清学和家系调查的方法。 1990年 Yamamoto等克隆了糖基转移酶基因,使ABO血型基因型的检测成为可能。

人类ABO血型的遗传由单基因（ABO gene）控制，该基因位于9号染色体长臂(9q34)，包含 7 个外显子，大小18kb以上。由三个等位基因组成 : i, IA, 和 IB.

H 抗原是ABO 血型抗原产生的一个必需前体。 • A allele 编码一个糖基转移酶glycosyltransferase，能将 α-N-乙酰半乳糖胺 Acetylgalactosamine结合到 H 抗原的 D-galactose（半乳糖）末端，从而产生 A 抗原. • B allele编码一个糖基转移酶glycosyltransferase，能将 α-D-galactose 连接到H 抗原的 D-galactose（半乳糖）末端，从而产生B抗原。 • O allele的exon 6由于包含一个缺失，使酶丧失活性。 O allele 与 A allele的差异在于单一核苷酸的缺失—261位置的鸟嘌呤缺失，引起移码突变，使翻译产生的酶失活， H 抗原不变，所以在红细胞膜上没有Ａ，Ｂ抗原的产生。

应用 PCR - RF LP技术进行 ABO基因分型 利用2对特异引物扩增2个不同的DNA片段引物1 5′-TGGGCGTGGAG ATCCTG AC-3′ 引物25′-GCACCGACCCCCCG AAGA-3′ 引物3 5′-G ACCGCACGCCTCTCTCCA-3′ 引物4 5′-ACCTTTCCCATCT ACCCTCT-3′

利用引物1 和2，基因A 、B 或O 都可以扩增出165bp的片段； • 只有B基因的扩增产物中包含限制性内切酶Alu I的酶切位点。 • 用限制性内切酶Alu I消化扩增产物，可切成不同大小片段，即165bp，119bp和46bp，（ 46bp在琼脂糖凝胶电泳中观察不到）。 • 119bp片段为纯合的 BB基因型, 165bp /119bp混合片段为含 B基因的 AB、 BO基因型, 165bp片段为不含 B基因的 AA、 AO或 OO基因型。。

利用引物 3和引物 4扩增的片段为 296 (295) bp。 • 用 Kpn I(5’- GGT AC↓C - 3’ )消化此扩增片段，可酶切成不同长度 DNA片段,即 296bp、 246bp和 49bp的 DNA片段 (49bp的 DNA片段太小,琼脂糖凝胶电泳结果无法观察到)。 • 296bp片段为不含 O基因的 AA、 AB或 BB基因型, 296bp /246bp混合片段为含 O基因的 AO、 BO基因型, 246bp片段为纯合的 OO基因型。

三、实验材料 1．实验材料：口腔黏膜细胞、带毛囊的头发 2．实验试剂和用品： DNA释放液：10 mg/ml蛋白酶K PCR反应液：包括特异性引物、dNTP混合液、 10×PCR反应缓冲液、Taq酶、无菌水 • 其它用具：牙签，1.5 ml 离心管，0.2 ml PCR反应管，吸头，移液枪

四、实验步骤 • 基因组模板的制备 1）以毛囊细胞为材料：取带毛囊的头发3根，将带毛囊的一端插入DNA提取液中，发梢部分剪去, 盖上Eppendorf管盖。 2）加入60 µl DNA释放液，头发插入后，涡旋片刻，离心片刻。 3）将样品放入55℃水浴中处理30分钟，中间取出Vortex一次。 3）30分钟后取出Vortex，离心片刻。 4）94 ℃ 处理10分钟。

2. PCR扩增 • 总体积20l • PCR反应液 15  l • DNA模板 5  l • PCR反应液中已包含PCR反应缓冲液、dNTP、Taq酶、引物。 • 同一个模板做2组PCR反应，分别以引物1，2或引物3，4。

PCR扩增程序 预变性：94℃ 5min 变性：94℃ 30s 退火：57℃ （引物1，2）50s 或52℃ （引物3，4）50s 延伸：72℃ 30s 重复35cycles 72℃ 15min

3. PCR产物的酶切 引物P1 /P 2扩增的 DNA特异片段用限制性内切酶 Alu I消化，引物P 3 /P 4的扩增产物用Kpn I酶切。反应体系： 15 μl 37℃酶切过夜 PCR产物 5 μl 10 ×buffer 1.5 μl 限制酶 0.5 μl H2O 8 μl

4. 酶切产物的电泳及ABO基因型分析 将酶切产物在 3%的琼脂糖凝胶中电泳 ,经 EB染色在UV 凝胶成像系统中观察结果并拍照相。 ABO基因 PCR扩增产物的电泳结果 M为 100bp DNA Ladder; 1～6为引物 3和引物 4扩增的特异片段; 7～12为引物 1和引物 2扩增的片段。

AA AO AB BB BO OO

作业 1.根据电泳结果，推测自己的血型及基因型。 2.根据全班的结果，统计基因频率及基因型频率。

实验七应用 PCR-RFLP 进行 ABO 血型分型