Material und Methoden

1. Die 5HT1a/b-Rezeptor-mRNA-Expression korrespondiert mit dem Zellwachstum unter hormoneller Manipulation in LNCaP-Zelllinien Igor Pirozhok* , Axel Meye , Susanne Füssel , Oliver W. Hakenberg , Manfred P. Wirth Klinik und Poliklinik für Urologie am Universitätsklinikum Carl Gustav Carus derTechnischen Universität Dresden *Diese Arbeit wurde unterstützt durch das „European Urology Scholarship Programme (EUSP-EAU) Stipendium S-02-2004 für I.P. Einleitung und Ziele Das Prostatakarzinom (PCa) rückt im Vergleich zu anderen malignen Tumoren des Mannes aufgrund seiner mit dem Alter steigenden Inzidenz immer mehr in den Fokus europäischer und amerikanischer Forschungsgruppen. Der kürzlich entdecke Signalübertragungsweg von Serotonin (5-HT) zur Regulation des malignen Prostatawachstums deckte neue Targets zur Antikrebstherapie über die Regulation von 5-HT-Rezeptoren (5HTR1a/b). Die Ziele unserer Arbeiten waren eine vergleichende Untersuchung der basalen, nichtstimulierten relativen 5HTR1a/b-mRNA-Expression in verschiedenen PCa-Zelllinien in Bezug auf die Wachstumsdichte; die Evaluierung der Effekte einer Androgenstimulation mit R1881 und deren Inhibierung mit dem Antiandrogen Bicalutamid (Casodex) auf die mRNA-Expression von 5HTR1a/b in der hormonsensitiven PCa-Zelllinie LNCaP. Ergebnisse und Diskussion Tab.1 Relative Expressionsraten der 5HTR1a- bzw. 5HTR1b-mRNA nach Normierung auf das Referenzgen HPRT (Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase) in PCa- und anderen Zelllinien. LD – „low density“ (geringe Wachstum Dichte) HD – “high density” (hoche Wachstum Dichte) Material und Methoden Verwendet wurden die humane androgensensitive PCa-Zelllinie LNCaP, die androgenunabhängigen PCa-Linien PC-3, 22RV1 und DU145 sowie die Kontrollzellen BPH-1 (DSMZ bzw. ATCC) und Fibroblasten. Die Zelllinien wurden in RPMI1640-Medium mit 10% FKS und 1% MEM (nichtessentielle Aminosäuren) antibiotikafrei in 75cm2-Kulturflaschen unter Standardbedingungnen geführt. Die Zellsplittung erfolgte aller 2-3 Tage mit einer Splittrate von 1:2 (LNCaP) bzw. 1:3-1:4 (andere Linien). Die Zellen wurden nach mikroskopischer Beurteilung bei verschiedenen Wachstumsdichten geerntet. Eine Zelldichte von <50% wurde als „low densitiy“ (LD) und von >75% als „high density“ bezeichnet abb.1). Die Eigenschaften der unstimulierten / uninhibierten Zellen wurden als „basal“ bezeichnet. Die Androgenstimulation und –inhibition von LNCaP-Zellen wurde in hormonfreiem RPMI-Medium mit 10% Aktvikohle-behandeltem FKS unter Zusatz des synthetischen Androgens R1881 (Methyltrienolon) in den Konzentrationen 1nM und 10nM sowie des Antiandrogens Bicalutamid (Casodex, 10µM) durchgeführt. Die LNCaP-Zellen wurden für 3, 6, 12, 24 und 48h mit R1881und mit bzw. ohne Bicalutamid inkubiert. Die Isolation von Total-RNA und die cDNA-Synthese wurden nach Standardprotokollen mit Hilfe des Invisorb Spin Cell RNA Mini Kits (Invitek GmbH) und der SuperScript RNAseH Reverse Transcriptase (Invitrogen) durchgeführt. Die mRNA-Expression der Serotonin-Rezeptoren 5HTR1a/b („TaqMan Gene Expression Assays“ von Applied Biosystems) wurde mittels die quantitativer „real-time“ PCR (QPCR) und der LightCycler-Technologie (Roche, Abb.2) gemessen und auf die des Referenzgens HPRT (Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase) bezogen. Abb.4 QPCR-LightCycler-Kurven der 5-HTR1a/b-Expressionmessung in LNCaP-Zellen in Abhängigkeit von der Wachstumsdichte. Die Expression wurde in Relation zum Referenzgen HPRT angegeben. Die basale 5-HTR1a/b-Expression ist niedrig im Vergleich der Standardkurven und mit anderen Zellinien. Abb.3 Relative Expressionsraten der 5HTR1a- bzw. 5HTR1b-mRNA nach Normierung auf das Referenzgen HPRT (Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase) in PCa- und anderen Zelllinien. *Fibroblast-LD Fibroblast -HD *BPH1-HD BPH1-LD PC-3 -LD Fibrobl -LD DU 145-LD *DU 145-HD *LNCaP-HD LNCaP-LD 22RV1-LD 22RV1-HD *PC-3-HD *DU 145-HD *LNCaP-HD Abb.6. QPCR Kurven 5HTR1a/b mRNA relative Expression nach Stimulation/Inhibition. Kap 1x 105-100 - Standard Kalibration Kurven; Wasser- Negative Kontrol, Kont VM, sfrei Cas, - kontrolen (Hormone +, Hormone –frei Medium, Casodex Kontrol) 1nM/10nM – 1nM R1881 und (-) 10µM Casodex Cas +10µM Casodex 3,6,12,24,48 St. – Zeit nach Stimulation/Inhibition (Stunden) DNS 100bp Abb.7 Die relative 5HTR1a/b mRNA Expression nach 3-48St. der Stimulation (R1881) und Inhibition (Casodex) im LNCaP Zellinien 1nM/10nM – 1nM R1881 und (-) 10µM Casodex Cas +10µM Casodex 3,6,12,24,48 St. – Zeit nach Stimulation/Inhibition (Stunden) Abb. 5 Agarose-Gel Elektrophorese der QPCR-Produkte der PCa-Linien und der Kontrollzellen in Abhängigkeit von der Wachstumsdichte. Die Signalintensität ist abhänig von der Wachstumsdichte als *Signal-HD>Signal-LD (p>0.005). LD – „low density“ (geringe Wachstumdichte) HD – “high density” (hoche Wachstumdichte) In allen untersuchten Zelllinien wurden Transkripte von 5HTR1a/b nachgewiesen. Dies könnte darauf hinweisen, dass diese Rezeptoren in normalen und malignen Zellen Signalüberträger funktionell aktive sind. Die stärkste Basalexpression (Abb.3, Tab.1) wurde in den PCa-Linien DU145 und 22RV1 nachgewiesen. Die schwächste mRNA-Expression wurde in den Linien LNCaP und PC-3 gemessen (Abb.3,4,5). LNCaP-Zellen sind hormonabhängig und benötigen eine Androgenstimulation für ein optimales Wachstum. Aufgrund der geringen Basalexpression in LNCaP-Zellen könnte eine Androgenabhängigkeit der Expression der 5-HT-Rezeptoren und eine mögliche Interaktion mit dem Androgenrezeptor (AR) vermutet werden. Unsere Daten zeigen eine Abhängigkeit der basalen 5HTR1a/b-Expression von der Wachstumsdichte bei allen Zelllinien außer bei Fibroblasten (Abb.3). Dieses Phänomen könnte vom Standpunkt des „Positiven Feedback“ aus erklärt werden. Um so stärker die Zellen proliferieren, um so mehr 5HT-Rezeptoren werden benötigt, um eine optimale Antwort auf Wachstumsstimuli geben zu können. Die unerwartet hohe Expression in Fibroblasten konnte durch deren Funktion als hochproliferative, gewebeverbindende Zellen bedingt sein. Eine andere Erklärung könnte sich aus der tragenden Rolle des Stromas bei der PCa-Progression und bei stromal-epithelialen Interaktionen abgeleitet werden. Die dominanten Stromazellen, die Fibroblasten, zeichnen sich durch ein hohes Proliferationspotenzial aus, Deregulierungen können beim normalen Wachstum ebenfalls innerhalb stromalen Gewebes auftreten. Der 5HTR1a/b-Signalweg in nichtstimulierten LNCaP-Zellen spielt nicht die Hauptrolle und ist niedrig gehalten in Korrespondenz zur Wachstumsdichte. Die Zelldichte dient möglicherweise als ein Mechanismus bei der Regulation der 5HTR1a/b-Expression in PCa-Zelllinien. Im Rahmen einer systematischen Medline-Rechereche der aktuellen Daten wurden keine Zusammenhänge zwischen 5-HT-Rezeptoren und der Zelldichte von PCa-Linien gefunden. Jedoch sind Interaktionen zwischen den 5HTR1a/b-Expression und dem AR bewiesen und sollten auch auf Proteinebene ausführlicher untersucht werden. Die Resultate der 5HTR1a/b-Expressionsmessungen nach Androgenstimulation mit R1881 und deren Inhibition mit Bicalutamid zeigte eine generelle Erhöhung der relativen 5HTR1a/b-Expression nach Stimulation und dementsprechend eine Verringerung nach Antiandrogenbehandlung (Abb.6,7). Diese Daten weisen auf eine gegenseitige Beeinflussung der AR-Stimulation bzw. Hemmung und dem 5HTR1a/b-Signalweg in der hormonsensiiven PCa-Linie LNCaP hin. Die 5-HTR1a/b-Expressionsmessungen nach R1881-Behandlung wurden maximale Transkriptmengen nach 6 h Inkubation mit 1nM R1881 (p<0.05) nachgewiesen, die nach 12 h wiederum signifikant abfielen. Im Zeitraum von 12-24 h. blieb die mRNA-Expression stabil niedrig. Der höchste stimulatorische Effekt auf die Expression (nach 6 h.) war stärker (> 3.75-fach) im Vergleich zur Basalexpression (p<0.05). Bicalutamid (10µM) inhibierte die 5HTR1a/b-Expression zeitabhängig mit einer maximalen Hemmung nach 24-48 h. Sowohl die stimulatorischen als die inhibitorischen Effekte sind signifikant während der ersten 8 h. (3-12 h.) mit einem Abfall der Rezeptorexpression im Zeitraum zwischen 12 und 48 h. (Abb.7). • Zusammenfassend kann gesagt werden, dass der maximale stimulatorische R1881-Effekt nur bei einer Dosis von 1nM und nur während der ersten 6 h. beobachtet wurde. Ein maximaler inhibitorischer Effekt der hohen Bicalutamid-Dosis (10µM) auf die 5HTR1a/b-Expression wurde nur nach einer Inkubationszeit von 12 h. beobachtet (Daten nicht gezeigt). Kürzlich wurde das Phänomen schrieben, dass niedrige Bicalutamid-Konzentrationen paradoxerweise zur Stimulation der AR-Aktivität führen [Unni E. et al. 2004]. Diese Autoren beschrieben eine biphasische Wirkung der Androgenstimulation und von Bicalutamid auf die AR-Aktivierung, bei niedrigen Konzentrationen (1-10nM) mit stimulatorischen Effekten und umgekehrt mit einer antagonistischen Wirkung bei hohen Konzentrationen (10µM). Diese Daten weisen auf eine Assoziation mit der AR-Aktivität nach Stimulation/Inhibition hin, es gibt jedoch keine Belege dafür in der Literatur. Für 5HT-Rezeptoren in PCa-Zellen wurde die Rolle bei der malignen Proliferation und der Tumorprogression sowie beim Übergang zum hormonrefraktären Status untersucht [Dizeyi N. et al. 2004]. Die Ausbildung eines hormonrefraktären PCa (HRPC) könnte mit einer erhöhten 5HTR1a/b-Expression einhergehen, was über die verbesserte Übertragung von Wachstumssignalen vermittelt sei könnte. Dennoch muss man beachten, dass die basale, nichtstimulierte 5HTR1a/b-Expression relativ gering ist. Daher könnte jede Arte der Induktion einer HTR1a/b-Expressionserhöhung die Gefahr des Übergangs zum HRPC darstellen. Die Folgen der möglichen Zusammenhänge zwischen dem Serotonin-Signalweges und dem androgenabhängigen bzw. – unabhängigen PCa-Wachstums sollten Gegenstand zukünftiger Untersuchungen sein. Mögliche Wechselwirkungen zwischen 5HTR1a/b und dem AR könnten auf Proteinebene vermutet werden. • Schlussfolgerung • Unsere Ergebnisse zeigen, dass die HTR1a/b-Basalexpression abhängig von der Zellwachstumsdichte verschiedener PCa-Linien ist. Die Effekte einer Androgenstimulation sowie deren Hemmung sind zeit- und konzentrationsabhängig. Die Daten unterlegen eine mögliche Korrelation der 5HTR1a/b-Expression mit Effekten der AR-Stimulation bzw.–Hemmung. Die Transformation zum HRPC könnte möglicherweise mit dem 5-HT-Signalweg verbunden sein, was in Folgestudien analysiert werden sollte. • Referenzen • Dizeyi N, Bjartell A, Nilsson E, Hansson J, Gadaleanu V, Cross N, Abrahamsson PA.Expression of serotonin receptors and role of serotonin in human prostate cancer tissue and cell lines. Prostate 59:328-36 (2004) • Sobel R.E., Sadar M.D. Cell lines used in prostate cancer research: a compendium of old and new lines – part1/2. J Urol. 173: 342-359 (2005) • Unni E., Sun S., Nan B. et al. Changes in androgen receptor nongenotropic signaling correlate with transition of LNCaP Cells to Androgen Independence. Cancer Res 64:7156-7168 (2004) • Shi X.B., Ma A.H., Tepper C.G., Xia L. et al. Molecular alterations associated with LNCaP cell progression to androgen independence. Prostate 60:257-271 (2004) • Chung LWK., Baseman A., Assikis V., Zhau H. Molecular insights into prostate cancer progression: the missing link of tumor microenviroment. J Urol. 173: 10-20 (2005) LNCaP-LD LNCaP-HD DU 145 -LD DU 145-HD 22 RV1 –LD 22 RV1-HD PC3-LD PC3-HD Fibroblasten BPH-1 Abb.1 PCa-Zellinien mit entsprechender Wachstumsdichte (LD<50%, HD>75%). CLSM-Fluorovert (Leica, Heidelberg), 79-fach bzw. 125-fach vergrößert. Abb.2 LightCycler (Roche, Mannheim) http://urologie.uniklinikum-dresden.de/ * piamop@mail.ru