DNA 的复制 DNA replication

DNA 的复制 DNA replication

一、DNA 复制假说 Watson和Crick提出的DNA复制方式为半保留复制方式；全保留复制：亲代DNA分子完整的转移到子代中；散布式复制：亲代DNA片段分散在子代DNA分子中。

Meselson－Stahl实验 1958年， Meselson和Stahl首先将大肠杆菌在含重同位素15N的培养基中培养约十五代，使所有细菌都被15N标记。然后移至只含有轻同位素14N的培养基中同步培养一代，二代，三代。分别提取DNA，作CsCl密度梯度离心，观察DNA的位置。

混合 123 15N-DNA 14N-DNA

对15NDNA、14NDNA杂交分子经加热变性，对于变性前后的DNA分别进行CsCl密度梯度离心。对15NDNA、14NDNA杂交分子经加热变性，对于变性前后的DNA分别进行CsCl密度梯度离心。结果变性前的杂交分子为一条中间密度带，变性后则分为两条区带，即重密度带（15NDNA）和低密度带（14NDNA）。

＊1963年Cairns用放射自显影方法阐明了大肠杆菌DNA的复制是半保留复制且DNA是环状分子。＊1963年Cairns用放射自显影方法阐明了大肠杆菌DNA的复制是半保留复制且DNA是环状分子。＊1957年Taylor用3H脱氧胸苷的溶液标记蚕豆，证明了真核生物染色体的复制也是以半保留复制方式进行的。 ●DNA分子是以半保留凡是进行复制，不管是原核还是真核生物。

二、半保留复制 1、定义 DNA在复制时,以亲代DNA的每一股作模板，合成完全相同的两个双链子代DNA，每个子代DNA中都含有一股亲代DNA链，这种现象称为DNA的半保留复制(semi-conservative replication)。

模板 • 原则 • 特点 • 亲代的DNA双链，每股链都可作为模板 • 按碱基配对原则指导新链的合成 • 合成的两个子代DNA分子碱基顺序与亲代分子完全一样 • 一条链来自于亲代的DNA链，另一条链是新合成的链规律

亲代DNA 子代子代新合成的链半保留复制

2、DNA半保留复制的类型 1）线性双链：双向、多重起始双向

θ型双向 2）环状DNA：θ型（双向、单向）、 D型、滚筒

滚筒复制

φX174RF是一个合成单链病毒圆环的模板

D型复制

1）底物：四种脱氧核糖核酸: 即dATP，dGTP，dCTP，dTTP 3、参与DNA复制的物质 2）模板：亲代DNA链作为模板。 3）引物： RNA作为引物(primer) ；原核生物:通常为50～ 100个核苷酸、真核生物:约为10个核苷酸；其顺序与其模板DNA的碱基顺序相配对

4）DNA聚合酶（DNA Polymerase）： • 以dNTP为前体催化合成DNA • 需要模板和引物的存在 • 不能起始合成新的DNA链 • 催化dNTP加到生长中的DNA链的3’-OH末端 • 催化DNA合成的方向是5'→3'

Kornberg酶（1956年） • 400个酶分子/每个细胞 • 单链多肽（109kD） • 大小二个片段（枯草杆菌蛋白酶处理） DNA聚合酶Ⅰ（DNA PolymeraseⅠ， PolⅠ） • DNA聚合酶有三种 • 具有多种酶活性的多功能酶 • 参与DNA复制的主要是polⅢ和polⅠ。 A原核生物聚合酶

5’ 3’ 外切酶 3’ 5’ 5’ 3’ 外切酶聚合酶 N C 小片段大片段（ klenow片段）（常用的工具酶） 76kD 34kD

5‘－3’聚合活性： ♦模板； ♦3‘－OH末端引物； ♦ 方向从5’－3‘。

切除错配核苷酸 错配硷基正确核苷酸复制方向 3´ 5´ 3´ 3´ 5´ DNA聚合酶Ⅰ的校对功能(3’-5’ 外切酶活性)

5’－3‘外切酶活性： ♦ 从5’-P端依次切除，可连续切除多个核苷酸； ♦ 只切配对的5’-P末端核苷酸； ♦ 既可切除脱氧核苷酸也可切除核苷酸； ♦ 对只有5’末端的切口也有活性。

DNA聚合酶Ⅰ的5‘－3’外切酶活性和聚合活性同时作用可进行切口翻译，制造放射性探针。DNA聚合酶Ⅰ的5‘－3’外切酶活性和聚合活性同时作用可进行切口翻译，制造放射性探针。

MW为120KD • 100个酶分子/每个细胞 • 聚合作用:只有DNApolⅠ的5% • 3’→5’外切酶活性 • 无5'→3'外切酶活性 • 对作用底物的选择性较强 • 不是复制的主要聚合酶 DNA聚合酶Ⅱ（DNA Polymerase Ⅱ， Pol Ⅱ）

pol Ⅲ由十种共22个亚基组成 • α亚基具有5’→3’聚合DNA的酶活性 • ε亚基具有3’→5’外切酶的活性 • θ亚基具有促进ε亚基外切酶的活性 DNA聚合酶Ⅲ（DNA Polymerase Ⅲ， Pol Ⅲ）

在复制叉处为一二聚体 • 核心酶（core enzyme）：α、ε、θ。α：聚合作用；ε：3’－5’外切；θ：与亚基结合有关； • γ、δ、δ’、χ、ψ提高反应速率和持续性； • β：使DNApol能结合在DNA上。β亚基结合于DNA时消耗ATP；如同一个夹子，使DNApolⅢ结合于DNA。 • τ：使两个DNApol单体形成二聚体，分别在复制叉的两个链上作用。

B真核生物聚合酶 五种 • DNA聚合酶α • DNA聚合酶δ和PCNA • DNA聚合酶γ • DNA聚合酶β、ε 功能： • 参与随从链的合成 • 参与前导链的合成 • 参与线粒体DNA的合成 • 参与DNA的修复

真核细胞几种主要DNA聚合酶的性质 DNA聚合酶 α β γ δ ε 蛋白质分子量（KD > 250 36-38 160-300 170 256 细胞定位核核线粒体核核 5’ →3’聚合酶有有有有有 3’ →5’外切酶无无有有有引物酶有无无无无

5）解链酶（unwinding enzyme/ helicase ）

6）引物酶（Primase） ♦本质：依赖DNA的RNA聚合酶（DDRP） Ecoli：60kD，DnaG 编码 ♦ 引发体(primosome)：引物酶＋引发前体（蛋白因子i、n、n”、dnaC、n’、dnaB）

5´ 3 DnaC Helicase(DnaB) primosome 3´ 5´ primase

蛋白因子i、n、n”与蛋白dnaC跟引物预合成有关；蛋白因子i、n、n”与蛋白dnaC跟引物预合成有关； • 蛋白因子n’和蛋白dnaB与识别复制起始点有关，并具有ATPase活性。

7）单链结合蛋白 • single strand binding protein, SSB • 能够与单链DNA结合的蛋白质因子 • 稳定单链DNA，不形成发夹结构 • 保护单链DNA，不受DNA水解酶作用 • 可重复使用，在滞后链上不断摆动，冈崎片段合成

TOPO酶：切割DNA链，使其松弛后再连接。 不需ATP，切割双链DNA中的一链，使DNA松弛后, 连接切口。 ♦TOPOⅠ: 切割DNA双链，此时不需ATP；尔后由ATP供能，使DNA分子成负超螺旋再连接切口。 ♦TOPOⅡ: 8）拓扑异构酶(topoisomerase)：可使DNA拓扑异构体互变的酶。

♦ 功能：与DNA形成共价结合中间体，使DNA磷酸二酯键断裂，形成DNAnick，DNA的一条链进行解旋旋转改变DNA分子的拓扑结构。参与复制、转录、重组。 ♦ 效应：可使DNA发生：连环化（catenate）、脱连环化（decatenate）、打结（knot）、解结（unknot）。

拓扑异构酶Ⅰ：MW＝100kD，单肽链，含3－4个Zn 作用： • 每次改变一个连环数； • 结合DNA，使该处溶解； • 形成酶－DNA复合物； • 切割双链中的一股，使DNA中的一股链穿越切割点； • 断裂单链连接

拓扑异构酶Ⅰ作用机理示意图

拓扑异构酶Ⅱ：又称旋转酶。 广泛存在于各种生物中。作用： • 使正超螺旋转化为负超螺旋。每次改变两个连接数。

拓扑异构酶Ⅱ的作用机制

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