BITKI DOKU K LT R TEKNIKLERI HAPLOID BITKI RETIMI Doku k lt r 3 Prof. Dr. Mehmet Babaoglu S. . Ziraat Fak ltesi Bitk

1. BITKI DOKU K�LT�R� TEKNIKLERI HAPLOID BITKI �RETIMI Doku k�lt�r� 3 Prof. Dr. Mehmet Babaoglu S.�. Ziraat Fak�ltesi Bitki Biyoteknolojisi Dersi

2. Somatik h�crelerdeki kromozom sayisi, ait olduklari bitki t�r�n�n gamet h�crelerinde bulunan kromozom sayisi kadar olan bitkilere haploid bitkiler denir. Haploid sayida kromozoma sahip h�crelerde (polen/mikrospor veya megaspor) veya bu h�creleri i�eren bitki kisimlarinin (anter veya ov�l) doku k�lt�r� yoluyla elde edilen h�crelerinde veya rejenerantlarinda yapilan kromozom katlanmasi sonucu homozigot bitkiler elde edilebilir. Bu teknige in vitro haploidi teknigi denir.

3. Haploidleri kullanmanin en basta gelen avantaji, tam bir homozigotiyi �ok kisa bir s�rede elde etme olanagini sunmasidir. Dihaploid hatlarin kullanilmasiyla genetik ve islah �alismalarini yapmak kolaylasmakta ve sonuca daha �abuk ulasilabilmektedir. Dihaploidizasyon y�ntemi devreye girdiginde homozigot hatlara bir generasyonda ulasmak olasidir. Dioik t�rlerde veya kendileme depresyonu nedeniyle klasik y�ntemlerle homozigotiye ulasmanin zor oldugu lahana ve �ilek gibi t�rlerde, dihaploidizasyon y�ntemi kullanilarak bu sorun bir generasyonda ��z�lebilir. �ok yillik meyve aga�lari ve orman bitkileri gibi tohumdan �i�eklenmeye kadar olduk�a uzun bir gen�lik kisirligi olan t�rlerde de haploidizasyon �nem kazanmaktadir. Bu t�rlerde kendilemeler m�mk�n olsa bile, homozigotinin elde edilmesi olduk�a uzun bir s�rede ger�eklesmektedir. Haploid bitki k�lt�rlerinin sagladigi bazi avantajlar;

4. F1 hibrit �esitlerin gelistirilmesinde homozigot hatlar arasinda �st�n kombinasyon yetenegi verenlerinin belirlenmesi y�ntemi kullanildigindan, haploidinin hibrit �esit islahinda �zel bir �nemi bulunmaktadir. Dihaploid bitkilerden elde edilen safhatlar F1 hibrit �esit islahinda ebeveyn olarak kullanilabilirler. Kombinasyon islahinda da sonuca �ok kisa s�rede ulasmayi saglayan haploidi sayesinde, F1 kademesindeki melez bitkilerden haploid �ekerek; farkli genotiplerde bulunan ve tek bir genotipte toplanmasi arzu edilen �zelliklere sahip bitkiler kazanmak m�mk�nd�r. Haploidizasyon, resesif mutasyonlarin a�iga �ikartilmasinda basvurulan en etkin y�ntemdir.

5. Haploid bitkiler, somatik hibridizasyon isleminin diploid protoplastlara g�re daha kolay yapilabilmesine olanak tanimaktadir. Ayrica iki haploid protoplastin birlesmesinin sonucu �diploid� olacagindan; protoplast k�lt�r� kullanilarak yapilan somatik hibridizasyon tekniginin bilinen dezavantajlarinin b�y�k bir kismi b�ylece ortadan kalkacaktir. Haploidler ve bunlarin katlanmasi ile gelistirilen dihaploidler sitolojik, fizyolojik ve genetik a�idan �nemli deneysel materyallerdir. Islah etkinliginin artirilmasi, haploidizasyonun sagladigi en �nemli avantajlar arasindadir (Gallais, 1978; Demarly ve Sibi, 1989).

6. Yonca ve patates gibi tetraploidlerin bulundugu t�rlerde haploidizasyon, diploid bitkilerin �retiminde kullanilabilmektedir. Elde edilen diploidler ticari olarak ilgin� olabilecegi gibi, bu yolla bazi tetraploid �r�nlerde; yabani t�rler ile k�lt�r �esitleri arasinda diploid seviyede melezleme yaparak kombinasyon yoluna gidilebilmektedir. Kendilemenin olanaksiz oldugu bazi dioik t�rlerde haploid uyartimi ve bunu takip eden kromozom katlamasiyla saf erkek bitkiler elde etmek m�mk�nd�r. Haploid bitkiler, farkli patojenler ve patojenlerin fizyolojik irklarina karsi in vitro seviyede se�ime olanak vermekte, hastaliklara dayaniklilik �alismalarinda zaman, yer ve maddi kazan� saglamaktadir. Dihaploid hatlarin g�ncel uygulamalarindan biri de gen haritalarinin �ikartilmasinda kullanimlaridir. DH hatlarda herhangi bir gen, ister bitki isterse marker seviyesinde olsun (genellikle RFLP ile belirlenmektedir); 1:1 oraninda a�ilacaktir. Bu durum, �zellikle poligenik olarak kontrol edilen bir karakterin haritasi �ikartiliyorsa �nem tasimakta ve kolaylik saglamaktadir.

7. Haploid bitki �retimi Erkek gametten haploid uyartimi (Androgenesis) - Anter k�lt�r� - Mikrospor k�lt�r� Disi gametten haploid uyartimi (Ginogenesis ve partenogenesis) - Ov�l ve ovaryum k�lt�rleri

8. Anter k�lt�r� Anter k�lt�r� esas olarak; i�erisinde olgunlasmamis polenleri (mikrosporlari) bulunduran anterlerin, tomurcuklardan ayrilarak in vitro kosullarda yapay besin ortamlarina yerlestirilmesi ve burada olgunlasmamis polenlerden haploid embriyolar elde edilmesi olayina verilen isimdir. Anter k�lt�r� yapilarak, normal kosullarda iki �ekirdekli yapiya d�n�secek olan polen tanesinin gametik gelisme y�n�; hen�z tek �ekirdekli d�nemdeyken somatik gelisme y�n�ne dogru �evrilmekte ve b�ylece �mikrospor androgenesisi� veya sadece �androgenesis� olarak adlandirilan olusum ger�eklesmektedir.

9. Androgenesisi etkileyen fakt�rler Androgenetik anter sayisi ve anter basina elde edilen embriyo sayisi, bir�ok fakt�r�n etkisi altinda bulunmaktadir. Anter k�lt�r�nden elde edilecek basariyi etkileyen fakt�rlerin bir b�l�m�, anterlerin alindigi don�r bitkiden kaynaklanmakta olup diger bir b�l�m� de anter k�lt�r� tekniginin uygulanmasi sirasindaki kosullarla iliskilidir.

10. Anter verici (don�r) bitkiden kaynaklanan fakt�rler a) Genotip: Anter k�lt�r�nde basari, �ok b�y�k bir oranda anterlerin alindigi bitkilerin genotipine baglidir. Simdiye dek �alisilmis olan t�m bitki t�rlerinde; ayni k�lt�r kosullari altinda, anter yanitlari bakimindan genotipler arasinda b�y�k farkliliklar bulunmustur. b) Don�r bitkinin yetisme kosullari: Don�r bitkinin genotipi son derece elverisli olsa bile, mikrosporlardan in vitro kosullarda haploid embriyo uyartimini basarabilmek, bu bitkilerin yetistirildigi kosullara da baglidir. Bitkilerin yetistirildigi d�nemdeki sicaklik, isik yogunlugu ve g�nl�k isiklanma s�resi, havadaki CO2 konsantrasyonu, bitkinin beslenme kosullari basta olmak �zere t�m �evresel fakt�rler, o bitkilerden alinan anterlerden elde edilecek basari �zerinde etkili olabilmektedir.

11. Anter k�lt�r� tekniginden kaynaklanan fakt�rler a) Anterlerin gelisme d�nemi: �ogu bitki t�r�n�n anter k�lt�rlerinde en iyi sonu�lar, tek �ekirdekli mikrospor d�neminin erken veya ge� asamasindaki mikrosporlari i�eren anterlerden alinmaktadir. Mikrosporlar i�erisinde nisasta depolanmaya basladiktan sonra, gelismeyi sporofitik y�ne kaydirmak ve haploid embriyo elde etmek i�in yapilacak uyarilar etkili olamamaktadir. b) Anterlere yapilan �n uygulamalar: �i�ek tomurcuklarina yapilan bazi �n uygulamalar, mikrosporlarin k�lt�r sirasindaki gelismesi �zerinde olumlu etki yapmaktadir. Anter k�lt�r�nde en etkili �n uygulama, tomurcuklara yapilan soguk soklaridir. 4-10 ?C�ler arasinda, 72 saat ile 4 haftaya kadar tutulan tomurcuklar, polen rejenerasyonu bakimindan olumlu yanitlar vermistir. Soguk soklarinin yanisira; tomurcuklara ethrel uygulamasi, santrif�j etme (Nitsch, 1974) gibi �n uygulamalar yapiliginda da, bunlarin anterlerden embriyo olusturma �zelligine olumlu etki yaptigi literat�rde yer almaktadir.

12. c) Besin ortaminin bilesimi ve yapisi: Bitki t�rlerinin �oguna cevap verebilecek bir anter k�lt�r� ortami bulmak kolay degildir. Anter yanitinin ayni t�rdeki farkli genotipler arasinda bile farklilik g�sterdigi bir olayda, ortak bir besin ortami �nermek olasi g�r�nmemektedir. Anter k�lt�r�nde genel olarak ilk asamada gametofitik dokulari sporofitik gelismeye d�n�st�rme y�n�nde uyaracak oksinler gerekli iken; bitkicige d�n�s�m asamasinda sitokininlerin varligina gereksinim duyulur. 2,4-D ve NAA�in siklikla kullanildigi anter k�lt�rlerinde oksin kaynagi olarak IAA�in de �alismalarda yer aldigi g�r�lmektedir. Sitokinin olarak da �ogunlukla kinetin, bunun ardindan BA ve zeatin kullanimi yaygindir. d) Ink�basyon kosullari: Ink�basyon sirasindaki isigin nicelik ve niteligi, ya da sicaklik gibi �evresel kosullar anter k�lt�r�nden saglanacak basari �zerinde etki yapan diger bir grup fakt�rd�r. Baslangi�ta anterler genellikle karanlikta ve 20 ila 30 oC�ler arasinda k�lt�re alinmaktadir. K�lt�r�n ilerleyen asamalarinda d�s�k isik yogunlugu (2000 l�ks) ve degisik g�nl�k isiklanma s�relerinde bekletilen anterlerde embriyo olusumu ger�eklestikten sonra; rejenere olan bitkicikler daha y�ksek isik yogunluguna (3000-10000 l�ks) sahip kosullara aktarilmaktadir. Ink�basyon s�resince uygulanmasi gereken isik yogunlugu ile sicaklik arasinda �ok kuvvetli bir korelasyon bulunmaktadir.

13. Mikrospor k�lt�r� Erkek gametten haploid embriyo elde etmek amaciyla anter k�lt�r� kullanilabildigi gibi, anterlerin i�erisinden �ikartilan (izole edilen) mikrosporlarin da k�lt�r� yapilabilmektedir. Olgunlasmamis mikrosporlarin, anter i�erisinden izole edilerek in vitro kosullarda �zel hazirlanmis besin ortamlarinda gelistirilmesi ve bunlardan haploid embriyolarin elde edilmesi islemine �mikrospor k�lt�r�� adi verilmektedir. D�nya literat�r�nde bu teknik, �isolated microspor culture� veya �pollen culture� bi�iminde de adlandirilmaktadir.

14. Ov�l ve ovaryum k�lt�rleri D�llenmemis yumurtaligin ya da yumurta h�crelerinin k�lt�re alinmasiyla haploid embriyo ve bitki olusumuna �ovaryum� veya �ov�l k�lt�rleri� adi verilmektedir. Ov�l veya ovaryum k�lt�rlerinden basari elde edebilmek i�in dikkat edilmesi gereken en �nemli noktalardan birisi, yumurtaligin alindigi �i�egin b�y�kl�g�, yani yumurtaligin fizyolojik olarak i�inde bulundugu gelisme d�nemidir. Yumurtaligin gelisme d�nemini pratik olarak belirleyebilmek i�in kullanilabilecek en etkili yol, ayni �i�ek i�erisinde bulunan anterlerdeki mikrospor gelisme d�nemlerini izlemektir.

15. Ginogenesisi etkileyen fakt�rler Disi gametten haploid embriyo elde etmeye y�nelik �alismalarda basariyi etkileyen �ok sayida fakt�r bulunmaktadir. Bu fakt�rlerin en �nde gelenleri, genotip, ana bitkilerin yetistirildigi kosullar, k�lt�r ortaminin bilesimi ve ink�basyon kosullaridir.

16. Haploid Bitkilerde Kromozom Katlama Haploid bitkilerin elde edilmesindeki temel yaklasim kuskusuz bu bitkilerin kromozom setlerinin iki katina �ikartilmasi (katlanmasi) ve %100 homozigot saf hatlarin hizla gelistirilmesidir. Kromozom katlanmasi bazi bitki t�rlerinde kendiliginden meydana gelmekle birlikte, pratikte �ogunlukla kimyasal madde uygulamalariyla ger�eklestirilmektedir. Bu ama�la azot protoksit, kafein, kloral hidrat, asenaften, sulfinilamid, etil merkuriklorid, hekzaklorosiklohekzan ya da kolhisin gibi antimitotik �zellik g�steren kimyasallardan yararlanilmaktadir. Yine bu ama�la 2,4 D ve NAA gibi hormonlar (Changdeng ve ark., 1998) ve trifluralin ve orizalin gibi bazi herbisitler (Bouvier ve ark., 1994; Hansen ve Andersen, 1998) de kullanilabilmektedir. G�n�m�zde kromozom katlamasi i�in bitki islah�ilari tarafindan en yaygin kullanilan kimyasal madde, kolhisindir.. Kolhisin, uygulandigi dokularin h�crelerinde mitoz b�l�nmenin metafaz safhasinda ig ipliklerinin olusumunu engeller ve dolayisi ile replikasyona ugramis kromozomlarin kutuplara �ekilmesini �nleyerek, kromozom sayisinin iki katina �ikmasini saglar.

17. BITKI DOKU K�LT�R� TEKNIKLERI HASTALKSIZ BITKI �RETIMI

18. Vegetatif �ogaltmada temiz bir baslangi� materyalinin kullanimi son derece �nemlidir. Temiz materyallerin elde edilmesi amaciyla bazi doku k�lt�r� tekniklerinden yararlanilmaktadir. Genellikle in vitro �ogaltilan bitkiler hastaliklardan ari kabul edilirler. Meristematik h�creleri kullanarak ger�eklestirilen doku k�lt�r� �zellikle vir�sten ari bitkilerin elde edilmesinde yaygin olarak kullanilmaktadir.

19. MERISTEM K�LT�R� Apikal s�rg�n ve k�k meristemi h�crelerinin vir�s i�erme ihtimali olduk�a d�s�kt�r. Meristematik h�creleri kullanarak ger�eklestirilen doku k�lt�r� �zellikle vir�sten arindirilmis bitkilerin elde edilmesinde yaygin olarak kullanilan bir y�ntemdir.

20. Meristem ve s�rg�n ucu k�lt�rlerinin uygulama alanlari Vir�ss�z materyal elde etmek Mikro�ogaltim Germplazm muhafazasi Genetik transformasyonlar Bitki materyallerinin uluslararasi degisimi Bakteri ve mantarlardan arindirilmis bitkilerin �retimi

21. Meristem k�lt�rlerinde basariyi etkileyen fakt�rler Bitki materyali - Eksplantin b�y�kl�g� - Don�r bitkinin fizyolojik durumu - Eksplantin alindigi mevsim - �esit K�lt�r ortami - Mineral tuzlar - Sekerler - Agar - B�y�me d�zenleyicileri K�lt�r sartlari

22. Bitki materyali Eksplantin b�y�kl�g�: B�y�k eksplantlarin daha y�ksek canlilik ve rejenerasyon kapasitesine sahip olmasina karsin, k���k eksplantlarin vir�s eliminasyonunda daha avantajli oldugu ortaya konmustur. Don�r bitkinin fizyolojik durumu: Meristem ucu eksplantlari bitkide vegetatif b�y�menin aktif oldugu bir d�nemde alinirsa k�lt�rde basari orani artmaktadir. Bunlara ilaveten don�r bitkilerin yetistirildigi �evre kosullari ile eksplantin bitki �zerindeki pozisyonu da basarida etkili fakt�rlerdendir. Eksplantin alindigi mevsim: Karanfilde meristem u�larinin erken ilkbahar ve sonbaharda alinmasi yaz ve kis aylarinda alinmasindan daha iyi sonu� vermistir. Papaya (Carica papaya L.)�da ise yazin alinan meristem u�lari diger mevsimlerde alinanlara g�re daha hizli gelismistir. �esit: Bitki doku k�lt�rlerinde iki genotipin ayni k�lt�r kosullari altinda her zaman benzer sekilde cevap vermedigi bilinmektedir. �alismalar, in vitro k�lt�rde farkli genotipler arasindaki bu �nemli farkliligi fizyolojik ve epigenetik fakt�rlerin de etkiledigini ortaya koymustur.

23. K�lt�r ortami Besin Ortami: Meristem k�lt�r�nde Murashige ve Skoog (1962) ortami (MS) ve bazi modifikasyonlari halen en fazla kullanilan ve en basarili sonu� veren ortamdir. Mineral tuzlar: Eksplantlar gen� fidanlardan alindigi zaman MS ortaminin uygun oldugu ancak olgun aga�lardan alinan eksplantlar i�in bu ortamin toksik oldugu ve bu eksplantlar i�in d�s�k tuz oranina sahip ortamlarin (Heller, 1953 gibi) daha elverisli oldugu belirtilmektedir. K�lt�r ortamindaki azot orani meristem k�lt�r�n�n basarisinda kritik bir etkiye sahiptir. Sekerler: Karbon kaynagi, meristem ucu k�lt�r� i�in kullanilan k�lt�r ortaminin �nemli bir unsurudur. Genel olarak t�m ortamlar bir karbon kaynagi olarak %1-3 sakkaroz i�erir. Agar: �ogunlukla eksplantlar yari-kati ortamda k�lt�re alinmakta ve k�lt�r ortaminda ortami katilastirmak i�in de agar kullanilmaktadir. Fakat bazi bitki t�rlerinde sivi ortam daha basarili bulunmustur. B�y�me d�zenleyicileri: Meristem ucu k�lt�rlerinde bitki t�r ve �esitlerinin b�y�me d�zenleyicilerine �ok farkli tepki g�stermeleri, k�lt�r i�in gerekli b�y�me d�zenleyicileri miktarlarinin �zerinde �alisilan �eside g�re belirlenmesi gerektigi sonucunu ortaya koymaktadir.

24. K�lt�r sartlari (�evresel fakt�rler) Isik, sicaklik ve fotoperiyot gibi �evre sartlarinin in vitro�da farklilasmayi etkiledigi bilinmektedir. Bu nedenle optimal kosullari her genotip i�in belirlemek gerekmektedir. Meristem ucu k�lt�rlerinin �esitli d�nemleri i�in k�lt�r �evresi kosullari arastirmalarla belirlenmeye �alisilmaktadir. Ayrica, k�lt�r �evresi kosullari ile beraber k�lt�r ortami, bitki b�y�me d�zenleyicilerinin kompozisyonu gibi farkli unsurlari da birarada incelemek gerekir.

25. Metodun uygulanmasi �ncelikle meristem eksplantlarinin alinacagi uygun bir bitki (don�r) se�ilir. Bu bitkiden en az bir bogum (nod) i�eren sap par�alari kesilir. Don�r bitkiye uygun olarak belirlenen sterilizasyon y�ntemi kesilen sap par�alarina uygulanir. Meristem ucu �ikarilacak bitki materyali binok�ler stereomikroskop tablasina yerlestirilir. Tomurcugun apikal meristemini g�rmek i�in �ncelikle yapraklar temizlenir sonra gen� yaprak taslaklari ile apikal kubbe kesilir. Ayrilan eksplant (meristem ucu) k�lt�r ortamina yerlestirilir ve k�lt�r kaplari k�lt�r odasina yerlestirilir ve genellikle 25 oC�de 4000 l�ks isikta 12-16 saat fotoperiyotta birakilir. Gelisen bitkicikler �ogaltim i�in bogumlarinin ayrilabilecegi b�y�kl�ge ulasincaya kadar in vitro�da gelismeye birakilir. In vitro�da gelisen bitkicikler steril kosullar altinda k�lt�r kaplarindan �ikarilir ve bogumlarina (aksiller tomurcugun bulundugu her bir par�a) ayrilir. Her bir par�a, aksiller tomurcugun b�y�mesini saglayacak taze ortama aktarilir.

26. Meristem ucu k�lt�r� �alismalarinda dikkat edilecek noktalar Don�r dokular gen� kisimlardan ve bitkinin aktif olarak b�y�yen b�lgelerinden alinmalidir. Meristem b�lgesi etil alkol ile silinmis binok�ler stereomikroskobu altinda yatay hava akisli kabinde �alisarak meristem b�lgesi izole edilmelidir. Meristemi ayirmak i�in kullanilan kesicilerin sik sik degistirilmesi ve sterilize edildikten sonra kullanilmasi uygun olmaktadir. Kurumayi �nlemek i�in sterilize edilen aletlerin sicak olmamasina dikkat edilmelidir (Sherwood, 1993). �ok k���k bir eksplantin (sadece meristematik kubbenin) k�lt�re alinmasi durumunda gelisme sansi d�s�k olmaktadir ve k�lt�rde basariyi sinirlayabilir. Bu nedenle, meristemin yaprak taslaklari ile birlikte k�lt�re alinmasi basarili bir k�lt�r i�in gerekli olmaktadir ve bu �meristem ucu k�lt�r�� olarak tanimlanmaktadir (Grout, 1993). Kesmenin bir sonucu olarak ortaya �ikan fenolik oksidasyon toksik etki yapabilir. Toksik etki nedeniyle ortamin kararmasi s�z konusu olursa meristemin derhal taze ortama aktarilmasi, d�s�k isik yogunlugu uygulamasi veya k�lt�r ortamina antioksidanlarin (askorbik asit, dithiothereital ve polyvinyl pyrrolidone) ilavesi ile bu fenolik bilesiklerin oksidasyonunun azaltilabilecegi de bildirilmistir (Grout,1993).

27. Meristem k�lt�r�n�n yararlari En y�ksek genetik kararlilik in vitro klonal �ogaltimda elde edilmektedir. Meristem k�lt�r� ile bulasik olan bir don�r bitkiden viral, bakteriyal, ve fungal patojenler uzaklastirilabilir. Meristem, sogukta muhafaza ve diger k�lt�r muhafaza teknikleri i�in homojen bir doku tipi olmasi ve k���k olmasi bakimindan �ok uygundur. Kimera olan bir materyalin aynen �ogaltimi i�in meristem k�lt�r� �ok uygun bir tekniktir. Meristem k�lt�rleri, karantina uygulamalarina g�re uluslararasi tasimada �ogunlukla kabul edilen k�lt�rlerdendir.

28. Meristem k�lt�r�n�n dezavantajlari Vir�sten arindirmada eksplant boyutu ile kontaminasyon derecesi arasinda negatif bir iliski vardir. Vir�sten arindirilmis bitkilerin elde edilmesinde stok bitkinin fizyolojik durumu etkili olmaktadir. Bu nedenle vir�sten arindirma sezon ile degismektedir ve her mevsim vir�sten arindirilmis bitkileri elde etme sansi m�mk�n olmamaktadir. Meristem k�lt�r�n�n vir�s eliminasyonunda etkili bir y�ntem olarak tanimlanmasina karsin meristemlerin her zaman vir�sten arindirilmis olmadigi da unutulmamalidir.

29. Vir�sten Ari Bitkilerin �retilmesi 1. Meristem ucu k�lt�r� 2. Sicaklik uygulamasi (termoterapi) 3. Meristem k�lt�r� ile birlikte sicaklik uygulamasi 4. Kimyasal madde kullanimi (kemoterapi) 5. Soguk uygulamasi (krayoterapi) 6. Mikroasilama 7. Vir�sten ari bitkilerin kallus ve protoplasttan elde edilmesi 8. Vir�sten ari diger eksplantlarin kullanilmasi

30. BITKI DOKU K�LT�R� TEKNIKLERI MIKRO�OGALTIM

31. MIKRO�OGALTIM Bir bitkiden alinan ve tam bir bitkiyi olusturabilme potansiyeline sahip bitki kisimlarindan (embriyo, tohum, g�vde, s�rg�n, k�k, kallus vb) yapay besin ortamlarinda ve aseptik kosullar altinda yeni bitkilerin elde edilmesidir. Eger bitkilerin uygun besin maddeleri ihtiyaci, hormon ve k�lt�r istekleri yeterince biliniyorsa, mikro�ogaltim teknigi kullanilarak t�m bitki t�rlerinin �retilmesi m�mk�nd�r (Hartman ve Kester, 1975).

32. Mikro�ogaltimin �nemi ve avantajlari; Hastalik ve zararlilardan arindirilmis bitkisel materyal elde edilmesi Kitlesel �retimde - �retilen bitkilerde fenotipik ve genotipik benzerlik - daha kisa k�lt�r s�resi - zor �retilen t�rlerin daha kolay �retimi - se�ilen belirli/�st�n genotiplerin hizli �retimi - �retimde daha az ana� kullanilmasi Somaklonal varyasyondan dolayi yeni �esitlerin/genotiplerin elde edilmesi

33. Mikro�ogaltimin dezavantajlari; Egitimli personel, �zel laboratuvar kosullari ve s�rekli arastirmaya ihtiya� duyulur. Yapilan �alismalarin maliyeti y�ksektir, bu durum �ogu zaman �alismalari sinirlar. Mutasyonlar, organ ve somatik embriyo olusumu, k�klenme problemleri, toksik bazi maddelerin besin ortaminda birikmesi, vitrifikasyon, kontaminasyon ve aklimatizasyon da ticari �ogaltimlarda karsilasilan temel problemlerdir.

34. Mikro�ogaltim asamalari Hazirlik asamasi K�lt�r baslangi� asamasi - Eksplant se�imi - Sterilizasyon - Baslangi� ortamlari - �evresel fakt�rler S�rg�n �ogaltim asamalari - Besin ortamlari - Kallus olusumu - Adventif tomurcuk olusumu -Aksillar tomurcuk olusumu S�rg�n gelisimi ve k�klendirme asamasi Dis ortama alistirma (aklimatizasyon) asamasi

35. Hazirlik asamasi Mikro�ogaltimin basarisi eksplantlarin alindigi ana� bitkinin genotipi, saglik durumu ve yetisme kosullari (beslenme, isik, sicaklik, bitki b�y�me d�zenleyicilerinin uygulanmasi, yetisme mevsimi) ile dogrudan iliskilidir. �evresel fakt�rlerin etkileri nedeniyle, yilin belirli d�nemlerinde eksplantlarin kalitesinde degisimler olmaktadir. Bu nedenle k�lt�r i�in, s�rg�n gelisiminin hizli oldugu ve aktif b�y�menin bulundugu d�nemler se�ilmelidir.

36. K�lt�r baslangi� asamasi Eksplant se�imi Mikro�ogaltimda �ogunlukla eksplant olarak tepe (apikal) ve koltuk alti (aksiller) tomurcuklar se�ilmekle birlikte, farkli organlar da eksplant olarak kullanilmaktadir. Bitkilerin toprak �st� organlari toprak alti organlarindan, bitki i�i par�alar bitki disindaki par�alardan daha az kontaminedir. Eksplant ne kadar k���k ise o kadar az kontaminasyon riski tasimaktadir. Eksplantin regenerasyon yetenegi b�y�kl�g�ne ve yasina baglidir. Eksplantlar gelisme mevsiminin baslangicinda aktif b�y�yen s�rg�nlerden alindiginda basarili sonu�lar elde edilmektedir. Ana� bitkinin yetisme kosullarindaki isik ve sicaklik kosullari, beslenme durumu ve yasi eksplantin b�y�me ve gelisme basarisini etkilemektedir.

37. K�lt�r baslangi� asamasi Sterilizasyon Mikro�ogaltimda kullanilan eksplantlar aseptik kosullara konulmadan �nce tam anlamiyla sterilize edilmelidir. Sterilizasyon y�ntemleri ana� bitkinin yetistigi ortamin �zelliklerine ve eksplantin alindigi organa g�re farklilik g�stermektedir. Kullanilacak dezenfektan maddenin cinsi, konsantrasyonu ve uygulama s�resi sterilizasyonun basarisini etkilemektedir.

38. K�lt�r baslangi� asamasi Baslangi� ortamlari Her bitki t�r� i�in kullanilan besin ortamlari benzer maddeleri i�ermektedir. Fakat k�lt�r amacina ve bitki �zelligine bagli olarak ortam bilesimi ve konsantrasyonlarinda degisiklik olabilmektedir MS ortami �ogu bitkiler i�in hem k�lt�r baslangicinda hem de s�rg�n �ogaltiminda kullanilmasinda iyi sonu�lar elde edilmesine karsin, bu ortamdaki tuzlarin orani bazi bitkiler i�in toksik ya da fazla gelebilir. Agar kalitesi t�m k�lt�r s�re�lerinde (adventif s�rg�n ve k�k olusumu) �ok etkilidir. Agardan kaynaklanan sorunlarin belirtileri kloroz, nekroz ve camlasma olup, agar tipi ve miktarinin degistirilmesi ile bu sorunlar ortadan kaldirilabilmektedir (Scholten ve Pierik, 1998).

39. K�lt�r baslangi� asamasi �evresel fakt�rler K�lt�r ortaminin sicaklik, isik, nem ve fotoperiyot durumu k�lt�r�n basarisini etkiler. Bu nedenle k�lt�r odasindaki isik, sicaklik ve nem bitki t�rlerinin istegine bagli olarak s�rekli kontrol altinda tutulmaktadir.

40. S�rg�n �ogaltim asamasi Besin ortamlari Genel olarak baslangi� i�in kullanilan ortamlar �ogaltim asamasinda da kullanilmakla birlikte, bazi durumlarda degisiklik yapilabilmektedir. Bitki dokularindan organ farklilasmasinda oksin ve sitokininler �nemli rol oynamaktadir. BAP �ok sik kullanilan ve genellikle olumlu sonu�lar veren bir sitokinindir. Genel olarak 1-2 mg/l sitokinin �ogu sistemde yeterlidir. Y�ksek d�zeyler, adventif s�rg�n olusumunu artirma egilimindedir. Thidiazuron (TDZ) d�s�k konsantrasyonlarda (0.05-1.0 mg/l) etkili oldugu i�in umut veren bir sitokinindir.

41. S�rg�n �ogaltim asamasi Kallus olusumu Bitkilerin �ok hizli �ogaltilmasi onlarin totipotensi (tek h�creden yeni bir birey olusturma) �zelligine baglidir. K�lt�re alinan h�crelerden bitkilerin farklilasmasi s�rg�n-k�k olusumu ya da somatik embriyogenesis ile meydana gelir. Kallustan s�rg�n �ogaltilmasinin en hizli y�ntem olmasina karsin bitkilerin klonlanmasinda bazi �ekinceler i�ermektedir. Bunun en �nemli nedeni h�crelerin stabil olmamasidir. Kallus evresini i�eren s�rg�n �ogaltiminin bir diger olumsuz yani ise bir �ok t�r i�in uygulanamaz olusudur.

42. S�rg�n �ogaltim asamasi Adventif tomurcuk olusumu Yaprak koltuk alti (aksiller) ya da s�rg�n tepelerinin (apikal) disinda herhangi bir yerde olusan tomurcuklar adventif tomurcuk olarak adlandirilir. Kalluslardan s�rg�n farklilasmasi da adventif tomurcuk olarak ele alinmasina ragmen, bu tomurcuklar kallus evresine gerek kalmadan dogrudan bir organ ya da organ par�asindan da olusabilmektedir. Bitkilerin bir �ogu degisik organlardan in vivo�da adventif s�rg�nler olusturmakta (Phlox k�klerden, Alstroemeria rizomlardan, Hyacinthus ve Iris soganlardan, Begonia, Pelargonium, Saintpaulia ve Streprocarpus yapraklardan) ve bu �zelliklerinden yararlanilarak vejetatif olarak �retilmektedir. K�lt�r kosullari altinda adventif tomurcuk gelisimi artirilabilmektedir.

43. S�rg�n �ogaltim asamasi Aksiller (koltuk alti) tomurcuk olusumu Aksiller tomurcuklar genellikle yaprak koltuklarinda bulunur ve her tomurcuk bir s�rg�n gelistirme potansiyeline sahiptir. Dogal olarak bu tomurcuklar bitkilerin gelisme d�nemlerine bagli olarak dinlenme halindedir. Terminal tomurcugun zarar g�rmesi ya da ortadan kaldirilmasi ile aksiller tomurcuk olusumu desteklenir. Mikro�ogaltimda, aksiller dallanmayla s�rg�n �ogalmasinin artirilmasi uygun konsantrasyonda ve tipte bir sitokinin i�eren (oksinli ya da oksinsiz) besin ortaminda yapilir. In vitro sartlarda olusan s�rg�nler taze ortamlara aktarilarak aksiller dallanma ile s�rg�n �ogalmasi s�rd�r�lebilir.

44. S�rg�n �ogaltim asamasi S�rg�n gelisimi ve k�klendirme asamasi Adventif ve aksiller s�rg�n gelisimi ortamlarinda sitokininin varligi k�klenmeyi engellemektedir. Tam bir bitki olusturmak i�in s�rg�nler, s�rg�n olusturma ortamindan farkli bir hormonal kompozisyona sahip olan yeni bir ortama aktarilmaktadir. S�rg�nler belirli bir uzunluga eristikten sonra k�klenmeleri amaciyla k�klenme ortamina alinir.

45. S�rg�n �ogaltim asamasi Dis ortama alistirma (aklimatizasyon) asamasi Steril kosullarda, d�s�k isik yogunlugunda, y�ksek nem i�eren ve t�m besin maddelerinin bulundugu bir ortamda gelistirilen bitkilerin, daha d�s�k nem, daha y�ksek isik d�zeyi ve steril olmayan kosullara sahip dis ortama aktarilmasi �ok dikkat isteyen bir islem olup, bunun asamali olarak yapilmasi gerekmektedir (Preece ve Sutter, 1993). In vitroda gelisen bitkiciklerin anatomik ve fizyolojik durumlarindan dolayi dis ortama aktarildiktan sonraki birka� g�n i�erisinde y�ksek nem i�eren bir ortamda tutulmalari hayati �nem tasimaktadir.

46. Mikro�ogaltimda Karsilasilan Sorunlar Vitrifikasyon Toksik bilesiklerin ortamda birikmesi ve kararma Kontaminasyon

47. Vitrifikasyon Elde edilen s�rg�nlerin sayisinin artirilmasi i�in alt k�lt�rler yapilmaktadir. Her bitki t�r� i�in kabul edilebilir bir alt k�lt�r sayisi vardir. Alt k�lt�rlerin sayisina ya da k�lt�r s�resine bagli olarak eksplant �zelligini kaybeder. Vitrifikasyon (camlasma), bu asamada karsilasilan en �nemli fizyolojik sorunlardan birisidir. Besin ortamindaki oksin, sitokinin, mineral madde, seker ve agar miktari vitrifikasyonun nedenlerini olusturmaktadir (Hempel, 1985).

48. Toksik bilesiklerin ortamda birikmesi ve kararma Mekanik yaralanma gibi stres durumlari ortaya �iktiginda, bitki dokularinda fenolik bilesiklerin metabolizmasi uyarilmaktadir. Eksplantlarin kesim y�zeyinden �ikan fenolik bilesiklerin oksidasyonu bazi bitki t�rlerinin k�lt�r�nde ciddi bir sorundur. Bu durum besin ortaminin kararmasina ve dokularda toksik etkiye yol a�arak, eksplantlarin gelisme ile farklilasma yeteneklerini ciddi olarak sinirlandirmaktadir. Kararma sorunu daha �ok odunsu t�rlerden alinan olgun dokularda yaygindir. Bu toksik bilesiklerin bitkiler tarafindan engellenmesi olduk�a zordur.

49. Kontaminasyon Doku k�lt�r�nde kontaminasyon, ekplantlarin dokularinda ya da y�zeylerinde bulunan organizmalar ve laboratuvar kosullarindaki hatalardan kaynaklanmaktadir. Bitki y�zeyleri mikroorganizmalarin dogal yasam alanlaridir. Doku k�lt�rlerinde kullanilan eksplanta bagli olarak mikroorganizmalar k�lt�r i�erisine tasinir. Meristem k�lt�r�nde kullanilan eksplantin b�y�kl�g�ne bagli olarak bir �ok organizma ortadan kaldirilabilirken, yaprak, yaprak sapi ve g�vdelerden alinan ekplantlarda mikroorganizmalar dokulardan uzaklastirilamazlar. Bu gibi durumlarda eksplantlardaki mikrobiyal kontaminasyon, hazirlik asamasinda bitki materyalinden y�zeysel dokularin �ikarilmasi ile azaltilabilmektedir (Cassels, 1993).

50. BITKI DOKU K�LT�R� TEKNIKLERI SEKONDER METABOLIT �RETIMI

51. Bitkiler, temel besin gereksinimlerini gidermek i�in gereken karbohidrat, protein ve yaglarin, yani primer metabolitlerin kaynagini olusturmaktadir. Besinsel �nemi �ok b�y�k olan bu bilesiklerden baska odun, sel�loz, zamk ve lastik gibi diger yararli maddeler de bitkilerden saglanmaktadir. Besin ve enerji saglama gibi yasamsal deger tasimamakla beraber, basta ila� sanayi olmak �zere; kimya, besin, kozmetik ve zirai m�cadele sekt�rlerinde ekonomik a�idan �ok �nemli ve yeri doldurulamaz bazi kimyasallar da yine bitkilerden elde edilmektedir. Bu kimyasallara genel olarak �sekonder (ikincil) metabolitler� adi verilmektedir.

52. Sekonder Metabolitlerin Ekonomik �nemi Bitkisel dogal �r�nler; bir�ok ila� ham maddesi gibi saf �r�nlerden, besin katki maddeleri ve kozmetikler gibi karisimlara kadar degiskenlik g�stermektedir. Ila� olarak kullanilan sekonder metabolitler Besin katki maddeleri olarak kullanilan sekonder metabolitler Parf�meri ve zirai m�cadelede kullanilan sekonder metabolitler

53. Ila� olarak kullanilan sekonder metabolitler Tarihle ilgili erisilebilen yazili kaynaklarda, ilk insanlarin �esitli hastaliklarin tedavisi i�in bitkilerden yararlandiklari belirtilmektedir. Elbette bu kullanim bi�imi etken madde olan sekonder �r�nden �ok, bitkinin kendisine veya degisik yollarla elde edilen �z�tlerine dayanmaktadir. Bug�n bile d�nya n�fusunun �ogunlugu i�in bitkiler ila�larin ham maddesi olarak kullanilmaktadir. Saglik a�isindan �ok �nemli bazi bitkisel kaynakli ila� etken maddeleri, elde edildigi bitkiler ve tedavi islevleri ile birlikte bitkisel k�kenli ila�lar sinifina dahil edilebilir. Ancak bu maddeler kontroll� ve yasal sinirlar dahilinde kullanildiginda ila� olarak adlandirilabilir. �rnegin, Erytroxylum coca�dan elde edilen kokain, lokal anasteziler i�in kullanilmakla beraber ayni zamanda yasa disi olarak uyusturucu ticaretinde de �nemli yer tutmaktadir. Ayni durum y�ksek derisimleri aliskanlik yapici ve sonunda �ld�r�c� olan morfin ve eroin i�in de ge�erlidir.

55. Besin katki maddeleri olarak kullanilan sekonder metabolitler Insanoglu i�in yasamsal degeri tartisilmaz olan bitki primer metabolitlerinin yani sira, tat ve koku verici maddeler de besin end�strisinde �nemli yer tutmaktadir. Sentetik katki maddelerinin mutajenik, karsinojenik ve teratojenik etkilerinin ortaya �ikisi ile birlikte; et, s�t, meyve, sebze, deniz �r�nleri ve mesrubat sekt�rlerinde dogal �r�nlere duyulan talep giderek artirmaktadir. Parf�meri ve zirai m�cadelede kullanilan sekonder metabolitler Bitkisel k�kenli �r�nlerden �zellikle parf�m olarak yararlanilmasi da �ok eski tarihlere kadar dayanmaktadir. �rnegin, Rosa (g�l) bitkisi t�rlerinden g�l yagi, Lavandula bitkisinden lavanta ve Jasminum t�rlerinden yasemin ilk �aglardan beri bilinen ve bug�n bile parf�m ve kozmetik sanayinde �nemli yeri olan bitkisel �r�nlerdir. Son yillarda bitkisel k�kenli dogal �r�nler zirai m�cadele amaciyla da kullanilmaktadir. Bunlarin en ilgi �ekici olanlari Chrysanthemum cinerariaefolium �i�eklerinden elde edilen ve insektisit olarak kullanilan piretrinlerdir

57. 1970�li yillardan itibaren bitki doku ve h�cre k�lt�rleri ile sekonder metabolitlerin biyosentezi arastirmalari d�nya �apinda hiz kazanmistir. Bunun iki �nemli nedeni vardir: Birincisi, son yillara kadar 2000�den fazla bitki t�r�n�n organ, doku ve h�cre k�lt�rlerinin ger�eklestigi rapor edilmistir. Bu k�lt�rlerin her biri i�in uygun besi ortamlarinin se�ilerek veya besi ortami bilesenleri d�zenlenerek arzu edilen kimyasalin �retilebilecegi d�s�n�lmektedir. Ikinci ve �ok daha �nemli olan bir gelisme ise, bitki h�cre k�lt�rlerinin �esitli kimyasallari �retebilecegine dair �ok sayida �alismanin ortaya �ikmasidir.

59. Dogal bilesiklerin bu alternatif y�ntem ile �retimi bazi b�y�k avantajlar saglamaktadir. Bunlar su sekilde �zetlenebilir: Ana bitkinin k�lt�r� veya toplanmasi esnasinda karsilasilan �evresel etkenlerin (iklim, cografi zorluklar, ulasim g��l�kleri, mevsimsel kisitlamalar vs.) ortadan kaldirilmasi, Arz-talep dengeleri g�z �n�ne alinarak gerektigi zaman yeterli �retimin saglanabilmesi ve b�ylece piyasanin d�zenli bir sekilde kontrol�, Daha sabit kalitede ve verimlilikte �retim, K�lt�r� yapilan bitkiler i�in daha az arazi kullanimi, Politik baskilardan uzak, daha serbest bir �retim.

60. Bitki H�cre K�lt�rleri ve Sekonder Metabolitler: Bitki h�cre k�lt�rleri ile yeni kimyasallarin �retimi ve bu �r�nlerin biyolojik aktivite g�stermeleri, farmakolojik a�idan b�y�k �nem tasimaktadir. �zellikle son yillarda biyolojik test sistemlerinde g�zlenen pratik, daha g�venilir ve �abuk sonu� almaya y�nelik iyilesmeler, h�cre k�lt�rleri tarafindan �ok d�s�k d�zeylerde �retilen biyolojik aktivite g�steren kimyasallarin saptanmasina olanak saglamaktadir. Bitki Doku ve H�cre K�lt�r� ile Sekonder �r�nlerin �retimi: Bitki doku ve h�cre k�lt�r� kabaca, aseptik kosullar altinda ve uygun besi yerlerinde bitki h�cre, doku veya organlarinin b�y�t�lmesi teknigidir. Dolayisi ile sekonder metabolitlerin �retiminde her teknigin kendine has �zellikleri ve �retimde sorunlari vardir. Genel olarak t�m tekniklerde karsilasilan sorun, bazi �zg�n sekonder metabolitlerin �retimindeki d�s�k verimliliktir.

61. Farklilasmis ve organize olmus k�lt�rler ile metabolit �retimi: Bitkilerde sekonder metabolizmanin b�y�menin belirli safhalarinda �zg�n doku ve h�crelerde ifade edildigi bilinen bir olgudur. Bu durum ayni zamanda h�crelerdeki b�y�me ve morfolojik farklilasma ile sekonder metabolizma arasindaki yakin iliskiyi ifade etmektedir. Ayni durum k�lt�r� yapilan h�cre, doku ve organ k�lt�rleri i�in de ge�erlidir. Morfolojik olarak farklilasma egilimindeki h�cre veya h�cre gruplarinda potansiyel olarak sekonder metabolit �retim olanagi daha fazla olmaktadir. K�k k�lt�rleri: Bitki tarafindan �retilen metabolitin sentez yerinin k�klerde bulundugu durumlarda, bu organdan alinan par�alarin, teorik olarak, ana bitkideki k�k h�creleri kadar veya daha y�ksek d�zeyde olmasi beklenir. Ancak �ok az bitki h�cre k�lt�r�nde sinirsiz b�y�me ile birlikte metabolit �retiminin saglandigi bildirilmistir.

62. S�rg�n k�lt�rleri: Bitkilerde sekonder metabolit birikimi ile s�rg�n primordiumlarinin olusumu arasindaki iliskiden yola �ikarak, s�rg�n k�lt�rleri ile madde �retimi ayrintili olarak irdelenmistir (Lindsey ve Yeoman, 1985). Bu tip k�lt�rler koltuk alti veya s�rg�n ucundaki meristem dokusundan alinan par�alarin uygun besi ortaminda b�y�t�lmeleri ile ger�eklesmektedir. S�rg�n ucu k�lt�rleri, farklilasmamis k�lt�rlere, yani kallus ve h�cre s�spansiyon k�lt�rlerine, nazaran daha y�ksek d�zeyde metabolit �retmektedir. Hatta bazen �retilen madde miktari ana bitkidekinden de y�ksek olabilmektedir.

63. Embriyo k�lt�rleri Sayet bir metabolit embriyoda �retiliyor veya birikiyorsa, bu metabolitin �retimi embriyo k�lt�rleri ile ger�eklesebilir. Ancak burada kastedilen kaynak bitkiden �ikarilip k�lt�r� yapilan embriyodan ziyade, somatik embriyo k�lt�rleridir. Bu k�lt�rler ya dogrudan somatik embriyogenezle yani kaynak bitki dokularindan (zigotik embriyo, kotiledon, yaprak ve hatta g�vde dokulari) aseks�el embriyolarin olusturulmasiyla ya da dolayli somatik embriyogenezle yani kallus veya h�cre s�spansiyon k�lt�rlerinde farklilasma tesvik edilerek embriyolarin olusturulmasiyla elde edilir. Somatik embriyo k�lt�rleri �zellikle lipidler gibi depo maddelerinin �retimi veya arastirilmasinda faydali kaynaklardir.

64. Farklilasmamis ve organize olmamis k�lt�rler ile metabolit �retimi: Kallus ve h�cre s�spansiyon k�lt�rleri bu grupta verilecek bitki doku ve h�cre k�lt�r� teknikleridir. Tek h�cre k�lt�rleri de bu gruba dahil edilebilir. Ancak bu k�lt�rler dogrudan sekonder metabolitlerin �retiminden ziyade, y�ksek verimli bitki varyantlarinin rejenere edilmesinde yararlanilmaktadir. Ana bitkiden alinan ve in vitro k�lt�r� yapilan dokularda farklilasmanin ortadan kalkmasi sekonder metabolitlerin belirgin bir bi�imde birikim kaybini da beraberinde getirmektedir. Birikimdeki bu kaybin nedenleri; Her hangi bir biyosentez yolunun �nemli basamaklarini kontrol eden genlerin, �zg�n bir islevi yerine getirmek �zere farklilasmayan dokularda ifade edilmemesi, Sekonder metabolitin �retimi i�in gereken substratin baska biyosentez mekanizmalarina kaymasi, Biyosentez yerlerinde biriken toksik �r�nler araciligi ile tasima mekanizmasinin engellenmesi, Sekonder metabolitlerin biriktigi depo b�lgelerinden yoksunluk, Sentezlenen metabolitlerin hizli yikimi olabilir (Charlwood ve ark., 1990).

65. Sekonder metabolitlerin �retilmesi konusunda h�cre s�spansiyon k�lt�rleri diger h�cre k�lt�r� tekniklerine ve �zellikle kallus k�lt�rlerine g�re daha avantajli sistemlerdir. Bu avantajlardan en �nemlisi, bu sistemlerin kallus k�lt�rlerine g�re daha �abuk b�y�mesidir. Mikrobiyal sistemlere benzerlik g�stermesi b�y�k �l�ekli k�lt�r sistemlerinin (�rnegin 10 litrelik k�lt�rler), yani biyoreakt�rlerin, olusumunu saglamaktadir. Bu k�tle olarak daha y�ksek h�cre verimliliginin saglanmasi anlamina gelmektedir. Ikinci olarak, h�cre s�spansiyon k�lt�rleri, kallus k�lt�rlerine nazaran morfolojik olarak daha homojendir. Bu durum alt k�lt�r yapildik�a zamanla baslangi� k�lt�r�nden farklilasma riskini ortadan kaldirir. Son olarak arastirma konusuna uygun olarak istenen h�cre hatlarinin olusturulmasi ve se�imi de bu k�lt�r sisteminin diger bir avantajidir.

66. Bazi sekonder metabolitlerin bitki h�cre s�spansiyon k�lt�rlerinde ve kaynak bitkideki verim oranlari (Stafford, 1991).

67. S�spansiyon K�lt�rlerinde Sekonder �r�n Veriminin Artirilmasi Bitkilerde sekonder metabolizmanin �evresel fakt�rlerden b�y�k �l��de etkilendigi bilinmektedir. Benzer sekilde bitki doku ve h�cre k�lt�rlerinde k�lt�r ortaminda yer alan beslenme fakt�rleri; yani karbon, fosfor, azot kaynaklari ve diger makro elementler ile bitki b�y�me d�zenleyicileri; yani oksinler ve sitokininler hem b�y�meye hem de metabolit olusumuna etki etmektedir. Kimyasal etkenlerin yani sira, ortamdaki �evresel (fiziksel) fakt�rler de in vitro sekonder metabolit �retimine dogrudan veya dolayli etkide bulunabilmektedir. Elbette bu fakt�rlerin her biri k�lt�r� yapilan bitkiye, k�lt�r tipine, h�cre hattina ve hatta k�lt�r�n yasina g�re etkide bulunmaktadir.

68. H�cre s�spansiyon k�lt�rleri ile sekonder metabolitlerin �retiminde biyoreakt�r veya ferment�r adi verilen sistemler sayesinde kapasiteyi binlerce litreye kadar �ikarmak m�mk�n olmaktadir. B�ylelikle end�striyel anlamda bitki h�cre k�lt�rlerinden yararlanma olanagi g�ndeme gelmektedir. Bitki h�crelerinin biyoreakt�rlerde k�lt�r� yapilmasinin iki �nemli avantaji vardir: K�lt�rlerin daha yakin denetimi. Kapali bir sistemde k�lt�r� yapilan h�crelerin bulundugu ortamdaki degisiklikleri denetim altina almak bir hayli zordur. Oysa biyoreakt�rlerde gazlar (oksijen ve karbondioksit), pH ve sicaklik gibi degisken fakt�rlerin yakin denetimi m�mk�m olmaktadir. Bitki h�cre k�lt�rlerinin end�striyel ama�li kullanilmasi i�in (�zellikle ekonomik a�idan �nemli metabolitlerin �retiminde) b�y�k �l�ekli k�lt�rler gerekmektedir. Bu k�lt�rler biyoreakt�rler ile saglamaktadir.

69. Ancak biyoreat�rlerde de �retim sirasinda �ok farkli problemlerle karsilasilabilmektedir. Bu nedenle maliyet hesabi yapildiginda biyoreakt�rler ile sekonder metabolit �retimi ekonomik olmayabilmektedir. Biyoreakt�rlerde �r�n olusumu i�in gerekli optimum kosullarin belirlenmesi ve korunmasi ��z�m bekleyen esas sorundur. Her bitki h�cre k�lt�r� i�in uygun biyoreakt�r tasarimlari, degisken olabilecek bu parametrelerin saptanmasi ile ger�eklestirilebilir.

70. BITKI DOKU K�LT�R� TEKNIKLERI GERMPLASM MUHAFAZASI

71. Tarimin baslangicindan beri tohumlarin yada �elik, yumru ve sogan gibi bitkisel materyalin saklanmasi yaygin bir uygulama olmustur. Bazi �esitlerin �retim alanlarinda monok�lt�r olarak artisi, ekolojik tahribat vs gibi nedenlerden dolayi k�lt�r� yapilan bazi bitki t�rleri, onlarin yabani akrabalari ve k�k �esitleri kaybolma tehlikesi (genetik erozyon) tasimaktadir. Bu y�zden genetik materyalin (tohum, tohumluk) canliliklarinin ve genetik �zelliklerinin bozulmadan saklanmasi �nem kazanmistir. Bu durum k�lt�r bitkilerindeki genetik tabanin giderek daraldigi ve ekolojik dengenin de giderek bozuldugu g�n�m�zde �zellikle de islah �alismalari a�isindan �nemlidir.

72. Muhafaza sekilleri amaca ve muhafaza edilecek bitki materyalinin �zelliklerine g�re farklilik g�sterir. Y�ksek verimli bitkiler ve degerli bitki materyalleri in vitro kosullarda �zelliklerini kaybetmeden uzun yillar saklanabilmekte ve bitkiler istenildiginde yeniden �retilebilmektedir.

73. �esitli bitki gen kaynaklarinin baslica muhafaza y�ntemleri

74. In vitro germplasm muhafazasinda iki temel metot kullanilir: Yavas b�y�tme teknikleri D�s�k sicaklik, d�s�k isik, b�y�meyi yavaslatici �zel ortamlar ve doku su kaybi gibi teknikler kullanilarak k�lt�rler 1 - 4 yil saklanabilmektedir. Krayopreservasyon �ok d�s�k sicakliklar (-196�C) kullanilarak h�cre b�l�nmesinin ve metabolik isleyislerin h�creye zarar vermeden durdurulmasiyla genetik materyal uzun yillar saklanabilmektedir. There are two basic types of germplasm preservation using micropropagation techniquesThere are two basic types of germplasm preservation using micropropagation techniques

75. Yavas yada azaltilmis b�y�menin esasi, bitki k�lt�rlerinin canli kalabilmelerinin izin verdigi oranda, k�lt�r ortaminin ve k�lt�r kosullarinin degistirilmesine dayanir. Yavaslatilmis b�y�me teknigi in vitro fideler, farklilasmis yapilar ve bitki s�rg�nlerinin muhafazasinda yaygin olarak kullanilmaktadir. Bu teknik bitki materyalinin farklilasma g�stermeksizin, patojenlerden ari, dogal felaketler ve zararlilardan korunmus bir sekilde �ok daha etkin bir sekilde korunmasini saglar. Genetik materyalin uluslar arasi degisimine imkan tanir. Tarla ve bah�e gen bankalarina g�re gerekli alan olduk�a azdir.

76. Yavaslatilmis b�y�me ile muhafaza i�in kullanilan y�ntemler 4 grupta toplanmaktadir; 1. K�lt�r ortaminin sicakliginin azaltilmasi ve isiklanma durumunun degistirilmesi 2. K�lt�r ortamlarinin i�eriginin degistirilmesi, hormonal yada ozmotik olarak b�y�meyi d�zenleyici, b�y�meyi azaltici maddelerin kullanilmasi 3. K�lt�r ortaminin hem sicakliginin hem de i�eriginin degistirilmesi 4. Gaz alisveris ortaminin degistirilmesi

78. Sogukta muhafaza (krayoprezervasyon), bitki �rneklerinin dakikada birka� �C, kademeli olarak sogutulduktan sonra sivi azota daldirarak muhafazasini ifade eder. H�cre b�l�nmesi ve metabolik islemler durduruldugu i�in yapilar bu islemden zarar g�rmezler. Krayoprezervasyon daha �ok kallus ve h�cre k�lt�rleri, somatik embriyolar, embriyonik k�lt�rler, meristem k�lt�rleri farklilasmamis k�lt�rler ve transgenik k�lt�rlerde kullanilmaktadir.

79. Sogukta muhafaza �nemli h�cre k�lt�rlerinin g�venle muhafaza edilebilecegi ve gerekli oldugu zaman istenen genetik materyalin saglanmasi amaciyla gelistirilmislerdir. G�n�m�zde 70�den fazla t�r ya da �eside ait k�lt�re edilmis h�cre ve meristem, sivi nitrojende depolanmayi takiben, yeniden hayata kavusturuldugunda yeni bitkicikleri (plantet) olusturmuslardir.

80. Soguktan korunacak h�cre ve meristemler �nce altk�lt�r islemlerinden ge�irilir. Bu uygulama ile; a) Kurutmaya ve donmaya toleransin tesvik edilmesi (amaca uygun genlerin ekspresyonu ile), b) H�cre i�i bosluklarin (vakuollerin) azaltilmasi ya da h�crede su oraninin d�s�r�lmesi, c) H�cre zari ge�irgenliginin artirilmasi, d) Sakkaroz ve �teki sekerlerin h�cre i�inde artirilmasi saglanir.

81. Sivilastirilmis gaz (nitrojen vb.) sicakligina sogutulmus (dondurulmus) h�crelerin canliligi �zerine dondurma islevinin �nemli etkisi vardir. Bitkisel h�crelerde donmanin iki tipi vardir: a) H�cre disi (ekstrasel�lar) donma b) H�cre i�i (intrasel�lar) donma H�cre disi dondurulmus h�creler, t�rlere g�re degisen �ld�r�c� (lethal) kritik sicakligin altinda sogutuldugu zaman �l�rler. Soguga duyarli bitkiler -5 oC�de bile h�cre disi donmaya dayanamazlar. Buna karsin soguga dayanikli bitkiler -70 oC�nin altindaki donlarda canli kalirlar. H�cre disindaki donmalar muhtemelen asiri b�z�lme ve su kaybindan dolayi dolayi zarara neden olurlar.

82. Asiri d�s�k sicaklilarda bitki h�cresinin canli kalabilmesi i�in �nemli fakt�r muhtemelen serbest sudur. Dondurucu (donma noktasi altindaki) sicakliklarda h�crelerin hayatta kalmasi i�in serbest suyun azaltilmasi mutlak gereklidir. Bu nedenle �ogu altk�lt�r�n (k�lt�r ortaminda 0,5 M sorbitol, 10 ppm ABA ya da %5 DMSO varliginda) sogukta muhafazadan �nce h�crelerde serbest suyun azaltilmasi ve h�crelerin daha az vakuol ihtiva eder duruma sahip olmasi istenir.

83. Sogukta muhafaza proseslerinde krayoprotektant (antifiriz) olarak kullanilan kimyasal bilesikler (Endreb, 1994).

84. K�lt�re edilmis h�crelerin ve meristemlerin sogukta muhafazasinda g�n�m�zde d�rt y�ntem ya da strateji uygulanmaktadir. Yavas �n dondurma kurallari Hizli �n dondurma kurallari Vitrifikasyon kurallari Kurutma kurallari

85. H�cre K�lt�rlerinin Canliligina Katkida Bulunan Bazi Fakt�rler Gelisme d�nemi i�inde belli bir d�nemin, basarili bir sogukta muhafaza i�in �nemlidir. Gerileme d�neminin basinda ve duragan d�nemde, ��z�nd�rme sonrasi canlilik d�zeyi d�s�kt�r. H�cre k�lt�rlerinin, sorbitol ��zeltisi (0.5-1.0 M) ya da �ok y�ksek kuvvetlendirici sakkarozun ilave edildigi k�lt�r ortamlarinda, donma �ncesi 16-48 saat i�in �n k�lt�re edilmesi, donma-��z�nme sonrasi iyilestirmenin gelistirilmesi a�isindan etkili bir y�ntem olarak bulunmustur. Soguktan koruyucu maddelerin (krayoprotektantlarin) h�cre sagligina etkili zararlarindan ka�inmak i�in, ��z�nd�rme sonrasi rutin bir islem olarak yikama d�neminde soguktan muhafazanin ilk g�zlemleri yapilmalidir.

86. Dezavantajlar Sogukta muhafazanin tesvik ettigi muhtemel genetik degismeler elektroforetik y�ntemlerle izlenmelidir. K�lt�re edilmis h�crelerde altk�lt�r farkliliklari, seleksiyon olayini epeyce tesvik etmektedir. Bazi bitki materyallerinin halen y�ntemlerin hi�birisiyle sogukta muhafaza edilememektedir.

87. �NERILER Bilim adamlarinin ve islah�ilarin bir merkezde toplanmali, Sogukta muhafaza tekniklerinin gelistirilmesi i�in bir merkez kurulmali Bu merkez egitim kurslari d�zenlemeli B�y�k bir merkezi gen bankasinda, b�y�k LN2 tanklarinda �alismalar y�r�t�lmeli �ok sayida h�cre hatti ve genetik kaynagi burada depolanmalidir.

88. BITKI DOKU K�LT�R� TEKNIKLERI EMBRIYO K�LT�R�

89. Y�ksek yapili bitkileri tohumlarindan ve tohum taslaklarindan embriyolarin izole edilerek belli ortamlarda k�lt�re alinmasi embriyo k�lt�r� olarak tanimlanmaktadir. Embriyo k�lt�r�, embriyonal b�y�me ve farklilasma �zerine besinlerin, bitki b�y�me d�zenleyicilerinin ve diger kimyasal ve fiziksel fakt�rlerin etkilerini incelemek i�in yararli bir tekniktir. Ayrica, agronomik olarak �nemli bitkilerin, bah�e bitkilerinin, orman t�rlerinin olgunlasmamis embriyolarindan bitkilerin gelistirilmesi ile t�rler ve cinsler arasi melezler elde edilebilmektedir. B�ylece �r�nlerin iyilestirilmesinde biyoteknolojik metotlarin uygulama alani �nemli �l��de genislemektedir. Bazi t�rlerde tohum dormansisinin �stesinden gelinmesi de bu teknik ile basarilmaktadir.

90. Olgun tohum embriyolarinin k�lt�r�: Bu k�lt�r olduk�a kolaydir ve basit bir k�lt�r ortami ile basarili sonu� alinmaktadir. B�ylece embriyonik b�y�meyi incelemek ve b�y�me d�nemlerini ortaya koymak, dormansi ve �imlenmenin metabolik ve biyokimyasal ayrintilarini analiz etmek m�mk�n olmaktadir. Olgunlasmamis erken b�l�nme fazindaki proembriyolarin k�lt�r�: Bu tip k�lt�r erken embriyo d�nemlerinden itibaren embriyolarin besin ihtiya�larinin ortaya konulmasini ve farklilasmasini saglamaktadir. Embriyonun izolasyonu olduk�a zor bir istir bu nedenle g�� olan bir k�lt�r y�ntemidir. Embriyo k�lt�rleri iki temel grupta incelenebilir:

91. Embriyo k�lt�r�nde, gelisen tohumdan veya tohum taslagindan olgun d�neme yakin bir d�nemdeki embriyolar izole edilirse bu embriyolar ototrofiktir ve enerji kaynagi i�eren basit bir inorganik ortamda gelisebilir. Olgunlasmamis embriyolari k�lt�re almada ise onlarin b�y�me ve gelismesine destek olabilecek bir k�lt�r ortami belirlemek �ok �nemli olmaktadir (Hu ve Zanettini, 1995).

92. Zigot olusumundan sonra ortaya �ikan (post-zigotik) uyusmazliklar in vivo melezlemelerde embriyo olusumunu veya olusan embriyolarin yasamalarini engellemektedir. Bu embriyolar �zel besin ortamlarinda doku k�lt�r� ile gelistirilmekte ve yeni melez bitkiler elde edilebilmektedir. Bu teknige embriyo kurtarma teknigi denilmektedir.

93. Embriyo K�lt�r� I�in Gereksinimler Embriyo k�lt�r�nde en �nemli konu farkli gelisme d�nemlerinde k�lt�re alinan embriyolarin d�zenli olarak gelisimini destekleyici bir k�lt�r ortaminin belirlenmesidir. Heterotrofik embriyolarin k�lt�r� i�in besin ortamlarinda mineral tuzlar, organik besinler ve b�y�me d�zenleyicilerinin bulunmasi gereklidir. Ayrica ortamin ozmotik basinci proembriyolarin basarili k�lt�r� i�in kritik bir fakt�r olarak belirtilmektedir (Bhojwani ve Razdan, 1996).

94. Besin ortami bilesimi: Embriyolarin b�y�mesi �zerine farkli sol�syonlarin etkisi arastirilmis ve genellikle en iyi gelismenin Murashige ve Skoog (MS) (1962) ve B5 (Gamborg ve ark., 1965) ortamlarinda oldugu g�zlenmistir. Ancak, MS sol�syonunun k���k boyuttaki embriyolar i�in toksik etkisi de g�zlenmistir. Mineral maddeler: Embriyo k�lt�r�nde mineral tuzlarin bir�ok farkli form�lasyonu kullanilmaktadir. Karbohidrat ve ozmotik basin�: Olgun veya olgunlasmamis embriyolarin k�lt�r�nde genellikle uygun bir karbon kaynagina gereksinim vardir. Sakkaroz, karbohidratin en iyi formudur ve embriyo k�lt�r� i�in �ok yaygin olarak kullanilmaktadir. Sakkaroz k�lt�r ortamina enerji kaynagi olarak eklenmesinin yani sira ozmolariteyi de korumaktadir. Bu fonksiyon i�in sakkarozun optimum konsantrasyonu embriyo gelisme d�nemine g�re degismektedir. Aminoasit ve vitaminler: Embriyo k�lt�r� ortamlarinda azotun nitrat, nitrit veya amonyum formunda ilavesine ragmen degisik aminoasitlerin ortama ilave edilmesi de k�lt�re alinan embriyolarin b�y�me ve gelismesi �zerinde �nemli bir etkiye sahiptir (Raghavan, 1980). Aminoasitlerin tek basina veya kombinasyon halinde k�lt�r ortamina eklenmesi embriyo b�y�mesini uyarabilmektedir.

95. Dogal bitki ekstraktlari: Farkli bitki embriyolari farkli besin ihtiya�larina sahiptir. Tohum embriyolarinin k�lt�r�nde hindistan cevizi s�t�n�n k�lt�re alinan embriyolardan k�k, s�rg�n veya yaprak gibi �zel organlarin b�y�mesini tesvik ettigi g�sterilmistir. Diger bitkilerin endosperm ekstraktlari embriyo k�lt�r� ortamlarina nadiren ilave edilmektedir. Bunlarin uyarici veya engelleyici etkilerinin oldugu tespit edilmistir (Raghavan, 1980). Embriyo k�lt�r� ortamlarinda kullanilan diger bir madde aktif karbondur. K�lt�re alinan organ tarafindan salinan toksik maddeler veya ortamda iz miktarda mevcut olan engelleyici maddeleri absorbe etme yoluyla aktif karbonun embriyo b�y�mesini tesvik ettigi d�s�n�lmektedir (Raghavan, 1980). Bitki b�y�me d�zenleyicileri: Oksin, gibberellin ve sitokinin gibi eksojen b�y�me d�zenleyicilerinin ayri ayri yada kombinasyon halinde uygulanmasi ile primordiyal k�k ve s�rg�nlerin gelismesi ve morfogenesiste g�r�len modifikasyonlar arastiricilari embriyo b�y�mesinde hormonlarin rol� �zerindeki arastirmalara sevk etmistir (Raghavan, 1980). Embriyo ve embriyo segmentlerinin kallus olusturmasi i�in genellikle bir oksin veya sitokinin, ya da her ikisine ihtiya� duyulabilir. Bununla birlikte bazi bitkilerdeki dormansinin kirilmasi amaci disindaki �alismalarda k�lt�re alinmis olan olgun veya olgunlasmamis embriyolarin normal gelisimi i�in eksojen b�y�me d�zenleyicilerine ihtiya� duyuldugu konusunda yeterli kanit bulunmamaktadir (Bhojwani ve Razdan,

96. K�lt�r kosullari Embriyo k�lt�r�nde genel olarak b�y�me odasi sicakligi ve aydinlanmasi se�ilen bitki t�r�ne g�re degismektedir. Bazi t�rlerde 18 oC k�lt�r ortami sicakligi olarak uygun olurken bazi bitkilerde bu sicaklik 25 oC�ye �ikabilir. T�rlerin k�lt�rdeki isik istegi de birbirinden farklidir. Bazi t�rler devamli aydinlik isterken bazilarinda embriyolarin �nce karanlikta sonra aydinlikta ink�be edilmesi daha uygun olmaktadir.

97. Embriyo K�lt�r�n�n Uygulama Alanlari Biyolojik temel �alismalarda Tohumun �imlenmemesi durumunda �imlendirmede Islah s�resini kisaltilmasinda Yasamayan embriyolarin kurtarilmasinda Embriyo k�lt�r� ile haploid bitkilerin �retilmesinde Tohum canliliklarinin hizli test edilmesinde Ender bitkilerin �ogaltilmasinda

98. Embriyo K�lt�r�nde Basariyi Etkileyen Fakt�rler Genotip: In vitro k�lt�rde bazi t�rlerin embriyolarinin gelismesi �ok kolay olurken bazi t�rlerde olduk�a zordur. Embriyonun k�lt�re alindigi d�nem: �ok k���k embriyolarin in vitro gelismesi zordur. Embriyo in vivo�da ne kadar gelismis ise in vitro�daki gelisimi de o �l��de daha kolay olmaktadir. Besin ortaminin bilesimi: Olgun embriyolar basit bir ortamda gelisirken erken gelisme d�nemindeki embriyolar daha komplike bir ortama gerek duymaktadir. K�lt�r kosullari: Embriyo k�lt�r�nde sicaklik ve isik istegi bitki t�rlerine g�re farklilik g�sterir. Embriyolarin izolasyonu: Embriyoyu zedelemeden izole etmek �zellikle erken gelisme d�nemindeki embriyolarin s�spensorunun zarar g�rmemesi basari i�in �nemlidir.

99. BITKI DOKU K�LT�R� TEKNIKLERI SOMAKLONAL VARYASYON

100. Somatik h�crelerin in vitro rejenerasyonu mitotik b�l�nme ile ger�eklesmektedir ve bu bir eseysiz (aseks�el) �remedir. Klonal �ogaltim amaci ile kullanilan in vitro teknikler mikro�ogaltim teknikleri olarak da ifade edilmektedir. Ama�, ayni genetik yapida bitkileri �retmektir. Ancak, bu tekniklerde beklenmeyen ve kontrol edilemeyen varyasyonlar da ortaya �ikmaktadir. Bu t�r varyasyonlar dogal olarak meydana gelmektedir ve bunlar ya h�crelerdeki genetik degisimler yada h�cre ve dokulardaki ge�ici degisimler olarak ifade edilmektedir. K�lt�re alinan h�crelerde �ok yaygin olarak g�r�len ve mikro �ogaltimda istenmeyen bu fenotipik ve genotipik varyasyonlar bitki islahinda b�y�k �nem tasimaktadir. Bitki islahinda dogal varyasyonun daraldigi veya varyasyon meydana getirmenin zor oldugu durumlarda avantajli olarak degerlendirilen bu varyasyon yeni bir kaynak olarak g�r�lmektedir ve doku k�lt�rlerinde ortaya �ikan bu kalitsal degisikliklerin t�m� �somaklonal varyasyon� olarak tanimlanmaktadir (George, 1993).

101. Kallus olusturan veya totipotent olup yeni bitkiler meydana getirebilen h�creler uzun s�reli k�lt�rlerde veya kisa s�reli de olsa y�ksek bitki b�y�me d�zenleyicileri i�eren ortamlarda totipotensi yeteneklerini (kompotens) yitirebilmektedirler. Bu h�crelerden olusan yeni bitkilerde gen veya kromozom bozukluklari sonucu kalitsal ve fenotipik varyasyonlar (somaklonal varyasyon) ortaya �ikmaktadir. Bu varyasyonlar, yeni �esit gelistirme ve iyilestirmelerde islah�ilar tarafindan kullanilmaktadir. Somaklonal varyasyon sonucu ortaya �ikan degisiklikler arasinda, bazi pigmentlerin yapisindaki farklilasmalar sonucu �i�ek renginin, yaprak ve �i�ek morfolojisinin, tohum veriminin, bitki canliligi ve iriliginin, u�ucu yag kompozisyonu ve hastaliklara tolerans veya dayanikliligin degismesi sayilabilir.

102. Somaklonal varyasyonlar ile klasik yapay mutasyonlarin sebep oldugu varyasyonlar arasindaki farklar Somaklonal mutasyonlarin frekansi kimyasal ve fiziksel mutagen uygulamalariyla elde edilen mutasyonlardan daha y�ksektir. Mutasyonlar genellikle dominanttan resesife dogru olmaktadir. Mutagen uygulamalari ile elde edilen mutasyonlarda dominantlarin frekansi d�s�kt�r. Oysa somaklonlar arasinda dominant mutasyonlarin orani daha y�ksektir. Haploid bitki k�lt�rlerinden elde edilen mutant h�crelerde hem dominant hem de resesif mutasyonlar hemen g�r�lebilmekte ve homozigot mutant bitkiler elde edilebilmektedir. Somaklonal varyasyonun h�cre d�zeyinde seleksiyonu da baska bir avantajdir. �rnegin, t�t�nde k�lt�r ortamina tuz ilave edilerek bu kosullarda yasama yetenegi iyi olan tuza toleransli h�crelerden bitkiler rejenere edilmistir.

103. In vitro�da seleksiyon b�t�n bir yil boyunca yapilabilir. Deneme ortami devamli olarak kontrol altinda tutulabilir. Tarla yada sera sartlari i�in s�z konusu olan bazi riskler in vitro�da yoktur. In vitro �alismalar daha kisa s�rede yapilabilmektedir. Mutantlarin in vitro�da seleksiyonu in vivo�ya g�re bazi �st�nl�klere sahiptir:

104. Somaklonal ve epigenetik varyasyon Doku k�lt�rlerinde ortaya �ikan kalitsal degisiklikler somaklonal varyasyon, kalitsal olmayan degisiklikler de epigenetik varyasyon olarak ifade edilmektedir. Somaklonal varyasyon kalitsaldir yani d�le ge�er, epigenetik varyasyon ise d�le aktarilamaz. Bitki yasami boyunca epigenetik varyasyon tersine d�nebilir, oysa somaklonal varyasyon tersine �evrilemez. Somaklonal varyasyon �ogunlukla adventif meristemlerden meydana gelen bitkilerde g�r�l�rken, epigenetik varyasyon hem bu bitkilerde hem de apikal/aksiller meristemlerden meydana gelen bitkilerde g�zlenebilir. Epigenetik varyasyon �nceden tahmin edilebilir, oysa somaklonal varyasyon bilinemez (genellikle ayni kosullar ayni tip epigenetik varyasyona yol a�arken ayni kosullarda ayni tip somaklonal varyasyon meydana gelmez). Epigenetik varyasyon bir fizyolojik tepki, somaklonal varyasyon ise tesad�fen ortaya �ikmaktadir.

105. Doku K�lt�r� Tekniklerinin Varyasyonda Etkileri Doku k�lt�rlerinden elde edilen bitkilerin fenotipik ve genetik a�idan degisme olasiliklari bitkiciklerin hangi metotla �retildigine baglidir. Fenotipik varyabilite t�m cinslerin h�cre s�spansiyon k�lt�rlerinde ve kallus k�lt�rlerinde yaygin olarak g�r�lmektedir. Mutasyonlar, direkt organogenesis veya somatik embriyogenesiste daha az g�r�lmekte, kallus k�lt�rlerinden elde edilen bitkilerde ise (dolayli/indirekt rejenerasyon) ise daha sik g�r�lmektedir. Bu genetik degisimler genellikle kalitsaldir (George 1993). Mikro�ogaltimda ortaya �ikan genetik degisikliklerden sakinmanin en g�venilir y�ntemleri direkt s�rg�n olusumu, direkt embriyogenesis, bogum (nod) ve s�rg�n k�lt�r�d�r. S�rg�n k�lt�rlerinde g�r�len varyasyonlar muhtemelen ansizin olusan mutasyonlardandir. G�r�len �ogu degisiklikler ge�ici �zelliktedir.

106. Somaklonal varyasyonun orijini K�lt�r uyarimi d�nemi K�lt�r�n gelisme d�nemi Bitki rejenerasyonu d�nemi

107. Somaklonal varyasyonun nedenleri H�cre organizasyonunun varyasyonda etkisi Doku kaynagindaki varyasyon - don�r bitki orijinindeki degisimler - eksplant kaynakli varyasyon DNA metilasyonu N�kleik asit �nc�llerinin kaybi In vitro h�cre b�l�nmesindeki anormallikler Bitki b�y�me d�zenleyicilerinin �nemi K�lt�r ortaminin bilesimi K�lt�r s�resi Genotipin etkisi Stres

108. Somaklonal Varyasyonun Belirlenmesi Somaklonal varyasyonun belirlenmesi �esitli �alismalar ile m�mk�n olmaktadir. Somaklonal varyasyon fenotipik, sitolojik ve molek�ler d�zeyde incelemeler ile ortaya konmaktadir (De Klerk, 1990). Fenotipik varyasyonun �l��lmesi: Fenotip �zerine somaklonal varyasyonun etkisi genellikle bir veya daha fazla �zellikte sapma g�steren bitkilerin orani olarak belirlenmektedir. Kromozom sayisi varyasyonu: Bu t�r varyasyon mitotik h�crelerdeki kromozomlarin sayilmasi (genellikle k�k u�larinda), her h�crenin DNA i�eriginin �l��lmesi (sitofotometrik olarak), stoma bek�i h�crelerindeki kloroplast sayilarinin tespiti veya stoma boyunun �l��lmesiyle belirlenmektedir.

109. Somaklonal varyasyonun avantajlari Hizli bir varyasyon kaynagi olarak elverislidir. Bazi degismeler y�ksek frekanslarda meydana gelebilir. Agronomik �zellikler degisebilir. Bazi degisimler homozigottur. Yeni varyantlar ortaya �ikabilir. Yeni varyeteler �retilebilir.

110. Varyasyon �eside baglidir. Degisim frekansi �ok farklidir. �ogu degismeler istenmeyen degisimlerdir. Bazi degismeler kararsizdir. �ogu degismeler yeni degildir. Istenilen karakterler degismeyebilir. Istenilen karakter elverissiz tarla performanslari ile birlikte bulunabilir. Varyantlari tanimlamak i�in elverisli mark�rlerin kaybi s�z konusu olabilir. Varyantlarin yasal bir d�zenlemesi yoktur. Somaklonal varyasyonun dezavantajlari

111. Somaklonal varyasyon mikro �retimde b�y�k kayiplara neden olmaktadir. Bitki biyoteknolojisinde bitki islahi teknikleri somatik h�crelerden rejenerasyona dayanmaktadir. Bu t�r bitkiler somaklonal varyasyonun etkisi altindadir. Ancak istenmeyen mutantlar ayrilabilir. Fakat bu �ok yillik bitkiler i�in m�mk�n olmamaktadir. Bazi istenmeyen mutasyonlar hemen taninamayacak ve bu y�zden bu mutantlar uzaklastirilamayacaktir. Somaklonal varyasyon, h�cre k�lt�rlerinde sekonder metabolit �retimini de etkilemektedir.

112. Somaklonal varyasyonun bitki islahinda kullanimindaki sorunlar Kromozom sayi ve yapisindaki degisiklikler genellikle b�y�mede ve fertilitede istenmeyen d�zensizliklere neden olur ve canlilik azalir. Bu sebeplerden somaklonal varyasyonun ger�ekten bitki islahinda yeni bir varyabilite kaynagi olup olmadigi da tartisilmaktadir.

113. Bitki islahinda somaklonal varyasyonun yararlari Bitki islahinda bir varyabilite kaynagi olarak somaklonal varyasyonun en b�y�k avantaji genis bir varyasyon kaynagi olmasi ve hizla elde edilebilmesidir. Y�ksek frekansta kromozom katlanmasi ile poliploid bitkileri elde etme araci olarak kullanilabilir. Agronomik �zelliklerde (hastaliklara dayaniklilik, basaklanma ve olgunlasma tarihi, tane verimi, protein i�erigi ve tane kalitesindeki degisimler) varyasyon bu konularda seleksiyon yapabilme imkanini olusturur.