Replicação do DNA & Transposons

1. Replicação do DNA & Transposons Enzimas e Mecanismos Envolvidos na Replicação e Transposição do DNA Prof. Henrique S. Costa, M.Sc.

2. Mecanismos de Replicação • Início da replicação → pode ser ativada mais de uma vez em procariotos, mas somente uma vez em células eucarióticas (OriC). • Movimento da forquilha de replicação → unidirecional (parte da origem e segue replicando o DNA em uma só direção) ou bidirecional (2 forquilhas deixam a origem em direções opostas). • Direção da replicação→ sempre no sentido 5’→ 3’. • Semi-descontinuidade da replicação → a replicação ocorre de forma contínua numa das fitas do DNA e descontínua na outra.

3. Eucarioto Mecanismos da Replicação Início da Replicação Procarioto

4. Mecanismos da Replicação Movimento da Forquilha

5. Mecanismos da Replicação Direção da Replicação

6. Mecanismos da Replicação Semidescontinuidade da Replicação

7. DNA Polimerases • → enzimas que fazem a síntese de uma nova fita de DNA. • possuem a capacidade de adicionar nucleotídeos na extremidade 3’OH de uma região pareada do DNA (crescimento da cadeia no sentido 5’→ 3’). • DNA-polimerase I (pol I)→ primeira polimerase caracterizada (1956) por Arthur Kornberg. • Funções • → 928 aminoácidos • → 3 Domínios • → Replicação • → Reparo de erro • → Remoção de P’

8. Atividade de Polimerase AA 521  928: Polimerizar Atividade de Exonuclease 3’  5’ AA 324  517: Remove 1 nt Atividade de Exonuclease 5’  3’ AA 1  324: Remove ~ 10 nt DNA Polimerases NH2 COOH 1956: Arthur Kornberg

9. DNA Polimerases • → a atividade de exonuclease 3’→ 5’ apresenta-se extremamente importante para que o processo de replicação ocorra livre de erro. • reconhecimento e clivagem de pareamentos errôneos na extremidade 3’OH da fita nascente (correção de erro), eliminando apenas o último nucleotídeo adicionado pela polimerase. • → a atividade de exonuclease 5’→ 3’ remove blocos de nucleotídeos (10 nt) na ocorrência de quebras da ligação fosfodiéster (nick) ou falta de alguns nucleotídeos (gap).

10. Exonuclease 3’  5’ Processividade Polimerização Formação do dímero Síntese dos Fragmentos de Okazaki Estabilização DNA Polimerase III Holoenzima → enzima composta por vários grupos polipeptídicos (20 ou +), fundamental no processo replicativo do cromossomo de E. coli.

11. DNA-Polimerase de Eucarioto

12. Forquilha de Replicação • Durante o processo de replicação do DNA, 2 fatores devem ser considerados: • → as fitas do DNA têm polaridades opostas • → a DNA-polimerase sintetiza somente no sentido 5’ → 3’. • # Dessa forma, uma das fitas pode ser sintetizada de forma contínua, enquanto a outra só pode ser sintetizada de forma descontínua. • Fita contínua → 1 primer • Fita descontínua → vários primers (fragmentos de Okazaki)

13. Enzimas Envolvidas Na Replicação • Topoisomerases → promovem a quebra transitória nas pontes fosfodiéster adicionando ou removendo super-enrolamentos. • A enzima permanece ligada covalentemente ao DNA e permite que as fitas passem umas sobre as outras. • Estas enzimas mostram-se presentes tanto em células procarióticas como eucarióticas. • Helicases → promovem a quebra das pontes de hidrogênio entre as bases, separando as 2 fitas de DNA. • Essencial para que a forquilha de replicação possa se movimentar.

14. Enzimas Envolvidas da Replicação • SSBs → proteínas que se ligam à fita simples do DNA. • Evitam a formação de super-torções induzindo uma conformação do DNA ideal para a replicação e pareamento de bases (além de proteger a fita simples da degradação por nucleases). • Primases → promovem a síntese de pequenas seqüências de RNA (primers). • Para cada início de síntese de uma das fitas de DNA faz-se necessária a presença de um primer. • Encontra-se, normalmente, associada à DNaB e outras proteínas (primossomo). • Ligases → catalisam a formação das ligações fosfodiéster dos fragmentos de Okazaki.

15. Enzimas da Replicação 1. Topoisomerases 2. Helicases 3. SSBs 4. Primase 5. DNA-Polimerase 6. DNA-Ligase

16. Topoisomerase

17. Helicase

18. DNA-Polimerase

19. Replicação: Visão Geral

20. Término da Replicação PROCARIOTO • Em E. coli, podem existir 2 forquilhas de replicação que, durante o movimento bidirecional, encontram-se na região terminal Ter (180° a partir de oriC) • T1 e T2 → regiões de terminação (específicas para a direção do movimento da forquilha). • # Bidirecional – cada forquilha deve passar pela outra para finalizar a replicação. • # Unidirecional – a forquilha deve retornar à origem de replicação. • ■ genomas circulares → não oferecem problemas de replicação.

21. 180o Término da Replicação PROCARIOTO T2 100pb T1

22. Término da Replicação EUCARIOTO • Telômeros → regiões terminais dos cromossomos de eucariotos formadas por seqüências bastante conservadas e repetidas. • # Telomerase – enzima responsável pela adição destas seqüências repetidas (RNA-polimerase) nos locais onde ocorreu a retirada dos primers. • → reconhecimento e ligação ao telômero • → adição de nucleotídeos conforme o molde de RNA da enzima • ■ A perda de sua função leva à morte celular.

23. Término da Replicação Genomas Lineares → Telômeros

24. Término da Replicação Genomas Lineares: Telomerase

25. Término da Replicação Genomas Lineares: Telomerase

26. Transposons Década de 40: Barbara McClintock Descoberta dos Elementos Genéticos Móveis em Milho “Elementos Controladores” 1983: Prêmio Nobel de Fisiologia e Medicina

27. Transposons Elementos de Transposição • Procariotos e Eucariotos • Fonte de variabilidade genética • Ocorrem via DNA ou RNA • Mutações: Gênicas ou Estruturais • 2 a 20% do genoma dos seres vivos 700 a 20.000 pb

28. Inserção Tn Excisão Tn Transposons Alteração da Expressão Gênica

29. Transposons via DNA 1. IS: Seqüências de Inseção 2. Tn: Transposons

30. Transposon Simples IS1 Transposase Repetição Terminal Invertida Repetição Terminal Invertida Transposon Composto Tn1681 Enterotoxina IS1 IS1 Transposon Complexo Tn3 Transposase amp Resolvase Repetição Terminal Invertida Repetição Terminal Invertida Transposons via DNA

31. Transposons via RNA Retrotransposons (similares a retrovírus)

32. Mecanismos de Transposição • Clivagem não-alinhadas são efetuadas no sítio alvo • O transposon é unido às extremidades de fitas simples • As lacunas no sítio-alvo são preenchidas e seladas

33. Mecanismos de Transposição Replicativa Não-Replicativa Conservativa

34. Considerações Finais • A Replicação é a duplicação total do genoma. • Antecede as divisões celulares → Mitose e Meiose. • Mitose → manutenção de células somáticas. • Meiose → gera gametas (células germinativas). • Máxima fidelidade → evitar alterações (Mutações).

35. Considerações Finais • Enzimas envolvidas → topoisomerase, helicase, SSB, primase, DNA-polimerase e DNA-ligase. • Término da replicação → perda dos telômeros. • Telômeros → senescência e câncer. • Transposon → mecanismo de variabilidade.