Formation continue: Thérapies géniques et Biotechnologie De l’ADN malade à l’ADN médicament

1. Formation continue: Thérapies géniques et Biotechnologie De l’ADN malade à l’ADN médicament Marguerite Neerman-Arbez 9 Décembre 2005

2. But des recherches en génétique • Trouver la cause de la maladie pour mieux: • la diagnostiquer • la soigner • la prévenir

3. De l’ADN malade à l’ADN médicament • De la maladie au gène • Du gène à la thérapie

5. gtctaggagc cagccccacc cttagaaaag atgttttcca tgaggatcgt ctgcctagtt ctaagtgtgg tgagcacagc atgggtatgg cccttttcat tttttcttct tgctttctct

6. L’ADN malade…. Une mutation est une “faute de frappe” génétique Ce gène fait un facteur anticoronarien. normal Ce gène fuit un facteur anticoronarien. faux sens Ce gène fait un facteur antic. non sens Ce gène fait ------------------------rien. délétion texte de M.A. Morris

7. Comment trouver le gène/mutation? • Approche genome-wide linkage = positional cloning = reverse genetics • Approche gène candidat

8. La coagulation

9. Clonage positionnel • 1) Définir une région d’intérêt • 2) Obtenir un contig de clones d’ADN couvrant la région • 3) Identifier tous les gènes de cette région • 4) Choisir des gènes prioritaires pour recherche de mutations • 5) Recherche de mutations chez les personnes atteintes

10. Points de repères: Noms de rues, abris bus, panneaux… Points de repères: Noms de rues Panneaux Abris bus … La carte de Genève

11. La carte du génome humain... -D3S1768 12.0 -D3S2409 7.0 -D3S1766 13.0 -D3S1285 12.0 -D3S2406 9.0 -D3S2465 9.0 -D3S2459 3 Points de repères: les marqueurs

12. Analyse de marqueurs polymorphiques parents children A B C D affected

13. F5F8D • Rare, transmission autosomique récessive • Taux réduits de Facteur V et Facteur VIII (5-20 U/ dl) • Sévérité variable: • formes peu sévères (10-20 U/dl) • formes modérées (5-10 U/dl) • Pas de liaison avec les loci F8, F5 (1q23) et protein C (2q13)

14. A vos marque(ur)s…

15. Analyse de liaison 18q

16. Analyse des recombinants

17. Région candidate: 1 cM (~ 1 Mb)

18. ERGIC-53 • Protéine transmembranaire 53 kD localisée dans ER-Golgi intermediate compartment (ERGIC) • Homologie avec les lectines des légumineuses • Gène sur 18q21

19. SSCA

20. Analyse du gène ERGIC 53

21. Hétérogénéité allélique et génique Patient origin (C) F5/F8 Mutation ERGIC 53

22. Afibrinogénémie congénitale • rare, transmission autosomique et récessive • déficience complète de fibrinogène dans la circulation • temps de coagulation prolongé à l’infini • Sévérité du phénotype variable • décrite en 1920 • avant 1999, aucun locus génétique identifié

23. Afibrinogénémie • un candidat: le locus du fibrinogène > chromosome 4q31 > 3 gènes (FGB, FGA, FGG) > chaque gène code pour une partie de la protéine

24. Le locus du fibrinogène FGG FGA FGB 4q28-31 Scale: 10 kb Neerman-Arbez et al, Figure 4.

25. Analyse de marqueurs polymorphiques parents children A B C D affected

26. 1 G M F F M affected 2 3 4 5 6 7 8 9 FGAi3 Analyse FGAi3 ?

27. FGG-x7 FGA-x1 FGA-x5 FGB-x7 Analyse PCR du locus Neerman-Arbez et al, Figure 2.

28. Analyse Southern blot (BamHI) 17 kb 13 kb controls carriers patients

29. deletion PCR + + +     + + Résumé FGG FGA FGB probe 13 11.5 3.5 Southern: Normal 13 kb BamH1 fragments Deleted 17 kb del

30. 1 3 4 3 2 D 2 3 1 2 3 2 3 4 5 3 2 3 2 D 2 3 1 2 4 1 1 1 2 D 3 2 4 2 1 1 1 1 2 D 3 2 4 2 1 2 3 2 2 D 1 2 1 4 2 4q markers: D4S1625 D4S2962 FGAi3 D4S2934 D4s1629 6 7 8 9 3 1 3 1 D D 3 2 2 2 3 1 3 1 D D 3 2 4 2 1 2 1 2 D D 2 2 2 4 1 3 1 2 D D 2 2 2 4 Une mutation récurrente

31. Mutations afibrinogénémie

32. Implications pratiques • Un diagnostic moléculaire précis pour le patient et son médecin • Un diagnostic prénatal pour les familles

33. De l’ADN malade à l’ADN médicament • De la maladie au gène • Du gène à la thérapie

34. La thérapie génique • Doit être meilleure (i.e. plus sure, plus durable) que la thérapie actuelle si elle existe • Maladies monogéniques • Cancers • Maladies virales

35. Approches thérapie génique • In vivo • Ex vivo www.larecherche.fr

36. Un exemple de thérapie ex vivo: Hypercholesterolémie familiale • Augmentation des lipides sanguins, prédisposant aux atteintes artérielles, la plupart du temps fatales • Maladie monogénique due à des mutations du récepteur des LDL • Essais préliminaires sur les animaux concluants • Approche: hépactectomie partielle, isolation des hépatocytes, transduction in vitro, réinjection… • Thérapie « individualisée » • 800 boîtes de culture/patient traité! • Faible efficacité du transfert génique • Pas d’avantage selectif des hépatocytes corrigés, pas de colonisation du foie

37. Quelques essais de thérapie génique pour l’Hémophilie (A et B) • Essais prometteurs dans modèles animaux • Chez l’homme, plusieurs essais cliniques Phase I • In vivo: • Adenovirus-facteur IX • intramusculaire • dosage facteur IX = 0.5-1.6% • diminution besoin en facteurs concentrés • Mlv-facteur VIII-domaine B • intraveineuse • resultats en cours • Ex vivo: • transfection fibroblasts (self) in vitro avec cDNA facteur VIII- domaine B • reimplantation péritonéale • diminution besoin en facteurs concentrés • effet transient (10 mois)