1 / 51

Imunológia –praktické cvičenie č. 1.

Imunológia –praktické cvičenie č. 1. bunky imunitného systému. Použité zdroje. Buc,M. a kol.,: Praktické cvičenia z imunológie, vysokoškolské skriptá, PALAESTRA, Bratislava 1993, ISBN 80-88718-01-5 http://www.vpl.sk/zc/img/3_Kossarova_Imunodeficientne_stavy.pdf

tyson
Download Presentation

Imunológia –praktické cvičenie č. 1.

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Imunológia –praktické cvičenie č. 1. bunky imunitného systému

  2. Použité zdroje • Buc,M. a kol.,: Praktické cvičenia z imunológie, vysokoškolské skriptá, PALAESTRA, Bratislava 1993, ISBN 80-88718-01-5 • http://www.vpl.sk/zc/img/3_Kossarova_Imunodeficientne_stavy.pdf • Bunky imunitného systému dostupné na https.ics.upjs.sk~paulikovaimufilestahajimu2.pdf

  3. hematopoéza • Bunky imunitného systému • -rôzne dlhý čas života • - úbytok je dopĺňaný hematopoézou • Hematopoéza • - formovanie a vývoj červených a bielych krviniek z kmeňovej pluripotentnej bunky • -u dospelého jedinca prebieha najmä v kostnej dreni (medulárne) • -základom hematopoézy je • pluripotentná kmeňová bunka, ktorá sa diferencuje na lymfoidné a myeloidné kmeňové bunky

  4. Hematopoéza • -z kmeňových buniek vznikajú progenitorové bunky, ktoré sú nasmerované k diferenciácii na základné typy krvných buniek: • Erytrocyty • lymfocyty • trombocyty • monocyty • Granulocyty • -Hematopoéza je regulovaná najmä cytokínmi: • IL-3 (multilineage-CSF) • GM-CSF • M-CSF • G-CSF • erytropoetín • IL-4, IL-5, IL-6, IL-7,IL-8,IL-9

  5. klasifikácia • prítomnosť membránových znakov(rozpoznávacie glykoproteíny) na povrchu bunky • CD (na všetkých leukocytoch) • expresia receptorov na rozpoznávanie antigénov (len na T a B –Ly) • MHC antigény

  6. Systém bunkových znakov CD –znak (marker) • CD = cluster of differentiation • CD znak – jedinečná molekula alebo komplex molekúl,ktoré bunka exprimuje • Tieto molekuly pomáhajú diferencovať typ (subtyp) bunky, jej maturačné štádium, stupeň aktivácie... • Názov pozostáva z písmen CD a číslic (napr.:CD3,CD8,...)

  7. CD znaky • CD3 –len naT –Ly (na všetkých subtypoch) • CD4 –TH • CD8 –TC • CD19 –len naB –Ly • CD64 –monocyty • CD66 –PMNLs • CD68 –makrofágy • CD16 –NK bunky • CD40 –dendritické bunky • CD33 –všetkymyeloidnébb.

  8. Polymorfonukleárne lekocytyPMNL • Viaclaločnaté jadro a granuly v cytoplazme • Na základe rozdielneho farbenia granúl rozlišujeme 3 typy granulocytov: • Neutrofily–nefarbia sa ani bázickymi ani kyslými farbivami • Eozinofily–farbia sa kyslými farbivami na červeno • Bazofily–farbia sa bázickými farbivami na tmavomodro

  9. neutrofily • 60% z leukocytov (4,3–11x109/1lkrvi) • Veľkosť: 15μm • Nezrelé –tyčka (tvar jadra) • Zrelé – segmentované jadro Vcytoplazme: • -granuly s baktericídnymi látkami –primárne (azúrofilné) obsahujú hydrolázy, myeloperoxidázu • Sekundárne – obsahujú laktoferín, lyzozým, alkalickú fosfatázu, kolagenázu... • Glykogén –zdroj glukózy pri anaeróbnej glykolýze → PMNL môžu zostať v poškodenom tkanive s nízkym obsahom O2, napr. vmiestebakteriálnejinfekcie Bunková membrána: • Receptory (Fc R pre IgG, CR), adhezívne molekuly (integríny, selektíny

  10. neutrofily FUNKCIA: • Základné bunky 1. obrannej línie proti patogénom, cudzorodým bb. • Profesionálne fagocyty • enzýmy sekundárnych granúl rozkladajú antigén (Ag) • Dôležitá úloha v zápalovom procese (rýchla mobilizácia, uvoľnenie mediátorov zápalu)

  11. eozinofily • 4% zo všetkých PMNL • 18 μm V cytoplazme: • okolo 200 granúl – hlavný bázický proteín (MBP), kyslá fosfatáza, arylsulfatáza, eozinofilnáperoxidáza, kationický proteín eozinofilu • -MBP pôsobí toxicky na parazity a nádorové bb., väzbou na bazofilnébb. z nich uvoľňuje histamín Na membráne: - receptory pre IgE a zložky komplementu - dôležitá úloha pri alergických reakciách FUNKCIA: • proti parazitárnym infekciám (hlavne proti helmintom v črevnom trakte) • proti nádorovým bunkám • Účasť pri zápalových reakciách ( sú aktivované lymfocytmi) • alergické reakcie • schopnosť fagocytózy

  12. bazofily • <0.2% z Leu • Morfologicky sa podobajú tkanivovým mastocytom, • ochrana mukóznych povrchov tela Cytoplazma: • Granuly – veľké množstvo zápalových mediátorov (heparín,histamín...); • Neobsahujú peroxidázu Membrána: • Receptory FcRε(pre IgE) FUNKCIA: • -alergické reakcie • -nefagocytujú

  13. mastocyty • Tkanivové bunky • 30μm • Mononukleárne bunky s metachromatickyzafarbenýmigranulami • Relatívne maléjadro - v spojivovom tkanive, hlavne pri krvných, lymfatických cievach a pri periférnych nervoch - blízko epitelových povrchov(dýchací, tráviaci systém a koža) Cytoplazma: • granuly : zápalové mediátory (heparín,histamín...), neobsahujú peroxidázu Membrána: • -receptory FcRε(preIgE) Funkcia : hlavné bunky pri alergických reakciách

  14. Mastocyty

  15. monocyty • 6-8% – mononukleárnebb. • Okrúhly tvar, veľa cytoplazmy, veľké, excentricky uložené jadro Cytoplazma : vakuolizovaná, farbí sa slabo bazofilne (sivo-fialovo) . • (Monocytóza so zvýšením množstva leukocytov je aj priaznivým symptómom pri septických procesoch a infekčných ochoreniach) FUNKCIA: • Profesionálne fagocyty • APC • *Zrelé monocyty putujú z kostnej drene do krvi, kde zostávajú cca15-30 hodín Potom adherujú na cievny endotel a opúšťajú krvné riečištediapedézou, premiestňujú sa do tkanív, kde sa premieňajú na makrofágy.

  16. Monocyty

  17. Antigén prezentujúce bunky = APC(AntigenPresentingCells) • DENDRITICKÉ BUNKY (DC) • MAKROFÁGY • B -LYMFOCYTY • FUNKCIA: • vychytanie Ag • spracovanie Ag • prezentácia Agpeptidov špecifickým T -Ly

  18. makrofágy • Determinačné povrchové znaky: CD54, CD68, MHC, Fc receptory, C receptory Monocyt z krvi →prechod do tkaniva →premena na makrofág • mononukleárne fagocyty • dĺžka života 75 dní • antigén prezentujúce bb. = APC • Tkanivové makrofágy –1. obranná línia hostiteľa • VÝSKYT:- • Alveolárne v pľúcach • Kupfferove bb. v pečeni • histiocyty v spojivovom tkanive • mikroglia v CNS • osteoklasty v kostiach • peritoneálne a pleurálne v seróznych dutinách • Intravaskulárne v endoteli kapilár

  19. makrofágy • FUNKCIE: • Schopnosť rozpoznať, vychytať, spracovať a prezentovať antigén • fagocytóza • Expresia MHC molekúl II. triedy • Produkcia imunoregulačných látok • Schopnosť odovzdávať nešpecifické stimulačné signály • Produkcia reaktívnych molekúl

  20. Dendritické bunky DC • v nelymfatických periférnych tkanivách • Langerhansove bb.(koža, dlaždicový epitel ústnej dutiny, pažeráku a pošvy) • intersticiálne DC (srdce, obličky) • v cirkulácii : DC v periférnej krvi (0,4 %) • závojnaté bb.(aferentné lymfatické cievy) • v sekundárnych lymfatických tkanivách : vmedzerené DC • v medule týmusu týmusové DC

  21. Dendritické bunky (DC) • FUNKCIA: • najvýkonnejšie APC • schopnosť aktivovať naivné T –Ly • fagocytóza (častice a mikróby) • makropinocytóza (solubilnéAg) • Závojnatá DC + Ly

  22. lymfocyty • Ly : malý, stredný, veľký • Malý 8-12μm. Jadro: - okrúhle alebo oválne tvorené masami chromatínu Cytoplazma: • úzky lem, svetlomodrá • T–lymfocyty (65–75%) • B–lymfocyty(20–30%)

  23. lymfocyty

  24. lymfocyty • Lymfocyty - vyvíjajú sa z hematopoetickej kmeňovej bunky v kostnej dreni • T lymfocyty migrujú do thymusu, • B lymfocyty zostávajú v kostnej dreni • B lymfocyty - zodpovedné za humorálnu časť (Ab) • T lymfocyty - celulárna časť imunitnej reakcie

  25. B-lymfocyty: produkujú a secernujú Ab do telesných tekutín, zastupujú preto humorálnu imunitu • T-lymfocyty: reagujú priamo s cieľovými bunkami (napr. ktoré boli napadnuté vírusmi alebo tumorózne zvrhnuté), preto reprezentujú bunkovú imunitu • Obidve populácie majú na svojom povrchu odlišné glykoproteíny, ktoré môžu byť dokázané pomocou monoklonálnych protilátok

  26. T lymfocyty TH(helpery) CD4: - Regulujú humorálne aj bunkami sprostredkované imunitné odpovede – pomáhajú TS(supresory) CD8 : • Môžu potláčať imunitnú odpoveď TC(cytotoxické) CD8: • Efektorovébb. S cytolytickým účinkom • TDH(delayed-typehypersensitivityreaction)- • sprostredkujúoneskorenýtyphypersenzitivity • TH a TS majú odlišné vlastnéantigény, podľa ktorých sa identifikujú

  27. T lymfocyty • Dozrievanie v týmuse je sprevádzané identifikáciou provrchových označení CD (cluster of differentiation – diferenciačných antigénov) • CD3- prenášač signálu z antigénneho receptoru do vnútra bb, vedie k aktivácii b • CD4, CD8 prítomné pôvodne u spolu všetkých ly, umožňujú rozdeliť T-lymf. • CD4 - prítomný u T helper bb, komunikuje s molekulami HLA II • CD8 - prítomný u cytotoxických buniek, komunikuje s molekulami HLA I

  28. Špecifická imunita sprostredkovanábunkami • T bunky - po stimuláciisastávajú efektorovými bunkami (priamonapádajú a eliminujúbbnapadnutévírusmi alebotumoróznezmenené) - riadiaspoluprácurôznychimunitnýchbb (syntetizujú molekuly, ktorépomáhajúinýmbunkámzničiťpatogéna)

  29. B lymfocyty • B-bb dozrievajú v prostredí kostnej drene • Zrelé B-lymf nesú na svojom povrchu molekuly imunoglobulínov, ktoré slúžia ako špecifický receptor pre antigén. • V prítomnosti Ag (týmusindependentnéAg) alebo aj v spolupráci s T-lymf (týmusdependentnéAg) sa menia B-lymf na plazmatické bunky, ktoré produkujú veľké množstvo špecifických Ab

  30. Plazmatické bunky

  31. NK bunky • CD16, CD56,CD57 5–15% , slezina • Nulové bb.=non–B,non–T • Majú Fc receptory • Bunková zložka vrodenej imunity Funkcie: -lýza nádorových a vírusom infikovaných bb. (nešpecifická cytotoxicita bez predchádzajúcej senzibilizácie) - produkcia cytokínov zapájajúcich sa do regulácie iných procesov - rozpoznávajú cieľové bb. bez MHC restrikcie - IL-2; IFN zvyšujú proliferáciu a cytotoxickú aktivitu NK cytopl. Granuly obsahujú perforín, serínovúesterázu

  32. Izolácia mononukleových bb • Z periférnej krvi • Za fyziolpodm. : z 1 ml krvi....1-2x 106mononukl. bb.(lymfocyty a monocyty v pomere 80% : 10%) CIEĽ : oddelenie ery a granulocytov METÓDA: diskontinuálna gradientovácentrifugácia POSTUP: krv +heparín (konc. 10j./1 ml krvi) -premiešať + fyziol.roztok (1:1) - do skúmavky s 5 ml zriedenej krvi navrstviť 2,5 ml separačného roztoku (verografín) - 20 min. centrifugácia

  33. Izolácia mononukleových bb • VÝSLEDOK : • po centrifugácii sa nad separačným roztokom utvorí belavý prstenec mononukleových bb., ktoré odsajeme pipetou • Získané bb. centrifugujeme • Sediment 2x premyjeme vo fyziolog. roztoku • bb. spočítame v Bürkerovej komôrke (1x106 )

  34. Separácia T aBlymf. Na základe tvorby roziet • T a B lymf. : rôzne membránové receptory pre väzbu s ery iných živočíšnych druhov • T lymf. : receptor pre baranie ery – tvorba E-roziet • B lymf. : receptor pre myšie ery – tvorba M-roziet • Ery sa opracúvajú chemicky (neuraminidázou) – pevnejšia väzba s lymf.

  35. Separácia T aBlymf. Na základe tvorby roziet • POSTUP: • Suspenzia mononukleovýchbb. + premyté a resuspendované baranie ery (1:1), centrifugácia • Inkubácia 30 min. pri 4̊ C, navrstvenie separačného roztoku (verografín), centrifugácia • CIEĽ : • nad separač. roztokom ostanú nerozetujúcebb.(odsatie) • Rozetujúcebb. Sedimentujú na dno skúmavky • VÝSLEDOK: • Získanie suspenzie lymfocytov (T lymf.- E-rozety) (95% čistota)

  36. Rozetové testy • Aktívne rozety – vyššia avidita receptorov pre baranie ery (aj pri ich malom počte) • Celkové rozety – po 18 – 24 hod inkubácii pri nadbytku ery. • Aktívne rozety lepšie odrážajú imunitný stav pacienta

  37. Rozetové testy • POSTUP : - 5ml krvi do heparínu izolácia lymfocytov • Pridať suspenziu ovčích ery ( pre aktívne rozety v c 0,2%, pre celkové rozety 0,1%) • Pri stanovení celkových roziet – na 24 hod do ľadu CIEĽ : • počítanie lymfocytov a roziet v Bürkerovej komôrke VÝSLEDOK : • Rozeta : lymf. + najmenej 3 ery • Aktívne r. : 25 +/- 10% • Celkové r. : 65 +/- 10%

  38. Pod mikroskopom počítame počiet roziet a čistých lymfocytov do 100, počet roziet udáva % počet B alebo T lymfocytov Lymfocyt rozety Morč.ery

More Related