1 / 58

Replikace DNA

Replikace DNA. DNA replikace (kapitola 10) Replikace chromozómu u bakterií (kapitola 10) Replikace plasmidů (částečně kapitola 25 + 20) Replikace lineárních chromozómů u Eukaryot (kapitola 10) PCR (kapitola 6). Buněčné dělení vs. reprodukce. Jednobuněčný organismus.

urania
Download Presentation

Replikace DNA

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. Replikace DNA DNA replikace (kapitola 10) Replikace chromozómu u bakterií (kapitola 10) Replikace plasmidů (částečně kapitola 25 + 20) Replikace lineárních chromozómů u Eukaryot (kapitola 10) PCR (kapitola 6)

  2. Buněčné dělení vs. reprodukce Jednobuněčný organismus Mnohobuněčný organismus Buněčné dělení vede k diferenciaci (zvětšení objemu jedince a jeho komplexity) Reprodukce asexuální sexuální (meióza) • Buněčné dělení a reprodukce je simultální • Prokaryota (baktérie) • Eukaryota (Protista) • Horizontální přenos genů - přenos DNA bez reprodukce • Vertikální přenos genů - z generace na generaci

  3. DNA struktura fosfodiesterová kostra sense vlákno antisense vlákno báze malý žlábek velký žlábek DNA se skládázedvouantiparalelníchřetězcůtvořícívětšinoupravotočivoušroubovici. Bázejsouuvnitř, fosfo-diesterovákostrazvnějšku.

  4. DNA replikace • 50. léta

  5. DNA replikace - Meselson-Stahl pokus • 1958 • „ the most beautiful experiment in biology“

  6. DNA replikace • DNA musí být rozdělena na 2 vlákna (enzymatický komplex replisome) • Každé vlákno je replikováno (původní vlákno slouží jako templát)– replikace je semikonzervativní

  7. Obecný mechanismus replikace • Počátek replikace (ori) • DNA polymeráza (DNAP) • Vždy ve směru 5‘  3‘ • Leading strand vs lagging strand

  8. Obecný mechanismus replikace • DNA polymeráza potřebuje RNA primer • Okazakiho fragmenty (1000 – 2000bp) • Odstranění primerů exonuklázovou aktivitou DNAP • Ligace niků

  9. Obecný mechanismus replikace • Nukleotidy jsou prekurzory pro DNA syntézu • dNTPs jsou vytvořeny z NTPs ribonucleotide reduktázou, kromě dUTP

  10. Obecný mechanismus replikace • Polymerizace nukleotidů

  11. Obecný mechanismus replikace • DNA polymeráza (Objevena v roce 1956 A. Kornbergem (E.coli) • Syntetizuje ssDNA ve směru 5‘ - 3‘ • Může mít exonukleázovou aktivitu ve směru 3‘- 5‘ • Potřebuje primer • Neumí rozplétat dvouvlákno • DNA polymeráza III – replikační enzym • DNA polymeráza I – odstraňuje primery • DNA polymeráza II – reparační enzym

  12. DNA polymeráza III • Několik podjednotek • DnaE (-podjednotka, syntéza) • DnaQ (-podjednotka, proof-reading – korekturní aktivita) • HolE (-podjednotka, potřebná pro stabilitu) • DnaN (-podjednotka) • Přídatné podjednotky (, , , , ) – clamp loading complex

  13. DNA polymeráza III • Korekturní aktivita – proofreading activity • 1 chybana 109 bází

  14. Syntéza lagging, opožďujícího se vlákna • Okazakiho fragmenty • Priming complex – primosom • PriA vyváže SSB • Naváže se primáza (DnaG) • Syntetizuje krátký RNA fragment

  15. Syntéza lagging, opožďujícího se vlákna • Ukončení syntézy • Série fragmentů, které nejsou spojeny • 3-krokové spojení daných fragmentů: Ribonukleáza H, DNA polymeráza I a DNA ligáza

  16. Topologické problémy při replikaci DNA • Rozpletení dvoušrobovice (800b/s) pomocí helikázy • Oba řetezce je nutno oddělit a prootočit (-100 na 1000b) • Chromozom nemůže jen tak rotovat • Vzniklé napětí je uvolněno topoisomerázami (DNA gyrázou) • DNA gyráza zavádí negativní superspiralizace a tím uvolňuje pozitivní superspiralizaci způsobenou helikázou

  17. Replikační proteiny v E.coli

  18. Komplex replikační vidličky • Proteiny, které se účastní replikace • DNA gyráza • Helikáza • Single-strand binding protein • DNA polymerase

  19. Replikace kruhové molekuly • Baktérie • 2 replikační vidličky (-replikace) • DNA replikace a buněčné dělení je synchronizováno • iniciace replikace v ori (oriC) • Iniciační komplex obsahuje 5 proteinů: DnaA, DnaB, DnaC, DNA gyrázu, SSB • oriC obsahuje repetice 3x GATCTNTTNTTTTa 4x TTATNCANA • Vazba DnaA proteinu • Na rozvolněnou DNA se naváže DnaB a DnaC – začátek replikační vidličky • Helikáza aktivuje primázu a tím pádem syntézu primeru

  20. Replikace kruhové molekuly • Ukončení replikace – Ter místa • Replikace probíha v obou směrech (po směru a proti směru hodinových ručiček) • TerC, TerB, TerF • TerA, TerD, Ter E • Vážou Tus proteiny • Jejich delece jsou slučitelné se životem, replikační vidlička je nepotřebuje k ukončení replikace • Separace spojených molekul toposiomerázou IV

  21. Buněčné dělení a replikace • Generační čas E. coli od 20-ti minut po několik hodin • Replikace chromozómu vždy 40minut • Kompletace buněčného dělení 20 minut

  22. Replikon • Jakákoliv DNA či RNA schopna replikace (kruhová s ori, nebo linearní) • Genomy virů, viroids • Chromozómy - kruhové • Chromozómy - lineární (konce musí být chráněné před exonukleázovou aktivitou – smyčky, nebo proteiny) • Genomy mitochondrií a chloroplastů • Plasmidy – prokaryotické (kruhové a lineární) • Plasmidy – eukaryotické (2 u kvasinek) • Mitochondrie • Plastidy (primární a sekundární)

  23. Plasmidy • Kruhové molekuly DNA samostatně se množící • Vyjímka jsou lineární plasmidy a RNA plasmidy (zjednodušené RNA viry) • Parazitují na buněčném aparátu pro svou replikaci • Přinášejí buňce určitou selekční výhodu • Nemohou být bez buňky • Vyskytují se v různém počtu (obvykle 1-2 plasmidy/chromozóm, ale až 50) • Velikost plasmidu je velmi různá • Plasmidy mohou nést gen zajišťující resistenci na antibiotikum • Kryptické plasmidy (bez očividné funkce) • F-plasmidy – specificke pro E.coli a baktérie rodu Shigella a Salmonela • P-plasmidy – promiskuitní • Transferability vs mobility • Některé plasmidy mohou být lineární (z Borrelia a Streptomyces)

  24. Lineární plasmidy - vyjímka • Nalezeny u některých baktériích a hub • Nemají telomery • Vlásenková struktura chrání konce DNA u Borrelia (plasmid je velmi důležitý pro virulenci borélií) • dsDNA vazebné proteiny chrání konce DNA u Streptomyces

  25. Replikace plasmidu • Obousměrná replikace • Replikace valivou kružnicí

  26. Replikace valivou kružnicí je také používána viry • Stejný mechanismus replikace ukazuje na příbuzný vztah mezi plasmidy a viry

  27. Mechanismus replikace plasmidu F - konjugace • Nejstarší známý plasmid (byl náhodou přítomne v izolátu E.coli K12, Stanford, 1928) • Nízké copy number, 100kb • Konjugativní vlastnosti • Tra+ transfer positive plasmidy • tra geny (nejméně 30 genů) • F+ (donor) and F- (recipient) • Bakteriální sex

  28. Mechanismus replikace plasmidu F - conjugation • Replikace valivou kružnicí • ssDNA se pohybuje skrz konjugační most do druhé buňky • Některé malé plasmidy jsou tra-, ale mob+ (mohou být mobilizovány za přítomnosti Tra+ plasmidu)

  29. Přenos chromozomální DNA díky F-plasmidu • Integrace plasmid do chromozomu přes IS místa (insertion sequence) • baktérie, které mají F plasmid v chromozómu - Hfr strains • Celý chromozóm může být přenesen za 90 minut • F plasmid se umí vyštípnout z chromozómu, nese část chromozómu – F‘ plasmid

  30. Přenos chromozomální DNA díky F-plasmidu • Integrace plasmid do chromozomu přes IS místa (insertion sequence)

  31. Kontrola počtu plasmidů v buňce pomocí anti-sense RNA • High copy plasmid regulují svůj počet pomocí limitace startu replikace • Low copy plasmid – striktní regulace, replikují se s replikací buňky • Regulace studovaná pro plasmid ColE1 • Iniciace replikace ColE1 • Syntéze pre-primeru (555bp) – RNA_II • Je štípnut ribonukleázou H (volný 3‘-OH) • Tento enzyme je specifický pro DNA:RNA • DNA polymeráza pokračuje • NEBO • Syntéza RNA_I – 108bp, váže se na RNA_II • Ribunukleáze nemůže štípnout RNA_II • DNA polymeráza nemá volný 3‘-OH konecx • Replikace nemůže začít

  32. Závislost buňky na plasmidu • Buňka přežije pouze v případě, že si udrží plasmid • 2 komponenty produkované plasmidem: toxin (více stabilní) and protijed (méně stabilní) • Protein-based operon F-plasmidu: CcdA (protijed) a Ccd B (toxin, inhibuje DNA gyrázu) • RNA-based systém: protijed je antisense RNA, která neumožňuje translaci toxinu (Hos-killing protein – Hok and Sok antisense RNA) • Benefiční plasmidy • Resistence na antibiotika • Resistence na těžké kovy • Resistence vůči UV atd. (Table 20.01)

  33. Plasmidy s resistencínaantibiotika • R plasmidy • Objeveny během 2.svět. války v Japonsku • Bacteria Shigella resistentní vůči sulfonamidům • R plasmidy jsou transferu schopné • Resistentní kmeny baktérií jsou velmi problematické • Zákaz používaní lidských antibiotik na prevenci nákazy u zvířat • Použití v genovém inženýrství

  34. Resistance vůči -laktam antibiotikům • Nejrozšířenější skupina antibiotik (penicilín, ampicilín, cephalosporin) • Působí na buněčnou stěnu baktérií • Obsahují -laktam kruh • Resistence díky enzymu -laktamázy (bla gen) • Modifikace antibiotické struktury – více odolná na štěpení enzymem • Administrace antibiotika + lactam analogu (clavulanic kyselina), který se váže na enzym

  35. Resistence to chloramphenicol • Chloramphenicol, streptomycin a kanamycin • Působí na bakteriální translaci (vážou se na 23S rRNA) • Resistence: • Chromozomální mutace ribosomálních proteinů – nedojde k inhibici pomocí antibiotika, ale sníží se efikace translace • Plasmidová – chloramphenicol acetyl transferáza (CAT)

  36. Rezistence na aminoglykosidy • Streptomycin, kanamycin, neomycin • Obvykle 3 cukerné kruhy, z nichž alespoň jeden nese aminokyselinu • Vážou se na SSU ribozómu a inhibují translaci • Inaktivace jejich aktivit pomocí modifikací (fosforylace, acetylace, adenylace) • Resistence: neomycin phosphotransferase (npt gen) • Derivát kanamycinu U – Amikacin – jeho acetylace schopný cukerný zbytek je blokován hydroxybutyratovou skupinu – i přes to již došlo k evoluci nové N-Acetyl transferázy, která je schopna acetylovat tuto molekulu

  37. Resistence vůči tetracyklinu • Tetracyklin se váže na 16S rRNA a inhibuje translaci • Inhibuje prokaryotickou i eukaryotickou translaci (eukaryota ho aktivně neimportují, spíše naopak, efektivně ho exportují) • Resistence: • Plasmid R kódující transporter, který umožnuje efektivní export tetracycklinu zpět do prostředí

  38. Ti plasmids • Tumor-inducing (Ti) • Přenos mezi baktérií a rostlinou • Ti plasmid se nachází v baktérii Agrobacterium • Část plasmidu je přenesena do rostlinné buňky pomocí procesu připomínající konjugaci • Dojde k začlenění (náhodnému) do chromozómu a k expresi růstových hormonů – nádor a místo pro množení baktérie

  39. Ti plasmid • T oblast plasmidu obsahuje geny pro auxin (zvětšuje objem buňky), cytokin (indukuje replikaci buňky) a opin (zdroj energie pro bakéterii) • Ti plasmid může vstoupit také du kvasinkové a savčí buňky (v laboratoři) • Použití v genovém inženýrství • Arabidopsis thalianna – 27 000 genů přerušeno pomocí Ti plasmidu – inaktivace genu – studium fenotypu

  40. 2 plasmid kvasinek • Kruhová molekula 6318bp (dsDNA) • 50-100 kopií/haploidní genom • Nachází se v jádře!, váže histony a formuje nukleozóm • Použítí v genovém inženýrství – eukaryotický klonovací vektor • Skladba: • 2 obrácené repetice (rozdělují plasmid na 2774 a 2346bp) • Flp rekombináza (flippase) katalyzuje rekombinace, rozeznáva Frt místo • Může dojít k inzercím, či delecím daných segmentů pokud jsou ohraničeny Frt místy • Flp/Frt systém je podobný Cre/loxP systému

  41. Replikace lineárních chromozómů - telomery • Problém při replikace lineárních chromozómů • DNA polymeráza potřebuje primer • Po odstranění RNA primeru dojde ke zkrácení DNA • Buněčné hodiny • Telomery • OPAKOVANÉ KRÁTKÉ SEKVENCE (20-STOVKY), OBVYKLE 6 BÁZÍ • TTAGGG – OBRATLOVCI • TELOMERASE – PRODLOUŽÍ KONCE DNA O JEDEN TANDEM • PROTEKCE PROTI EXONUKLEAZOVÉ AKTIVITĚ • EXTRÉMNĚ KONZERVOVANÉ

  42. Replikace lineárních chromozómů • Protein primery • DNA polymeráza může použít volnou –OH skupinu z proteinu • Systém používán některými viry a bakterií rodu Streptomyces (lineární chromozóm)

  43. Replikace lineárních chromozómů • Mnoho počátků replikace (10 000 až 100 000 u dělící se somatické buňky) • Obousměrná • Replikační bublina • Synchronizace • každý chromozóm je replikován pouze jednou • každý počátek prochází iniciací pouze jednou

  44. Počátek replikace • Nejlépe studován u kvasinek • ORC komplex (origin recognition complex) se váže na na počátek replikace a spouští řadu reakcí: • Cdc6, Cdt1 a ORC a MCM (helicase) = pre-replicative complex (pre-RC) • Tento komplex se formuje pouze v G1 fázi • Pre-RC je aktivován kinázou S-CDK a aktivuje Sld2 a Sld3 • Sld2 a Sld3 se váže na Dpb11 a ten přináší cdc45a DNAP  • Pre-loading complex, pre-LC

  45. Syntéza eukaroytické DNA • Stejný princip jak u baktérií • Komplikovanější • MCM – minichromosome maintenance • DNAP  , ,  • DNAP  - primase – iniciace replikace, syntetizuje primer, který pak prodlužuje pomocí dNTPs – 20nt – iDNA • RPA A – replication protein A – chrání ss • RFC – replication factor C – váže se na iDNA, přibírá do komplexu posuvnou svorku (PCNA protein) + 2 DNAP • DNAP  - přepisuje opožďující se vlákno • DNAP  - přepisuje vedoucí vlákno • PCNA protein je trimer • Regulatory proteiny – Cdc45, GINS complex – neznámá funkce • Primery jsou odstraněny pomocí exonukleázy Fen1 a/nebo Dna2 (rozdíl oproti baktériím) • Mezery jsou dosyntetizovány DNAP  a spojeny pomocí DNA ligázy

  46. Rodiny DNA polymeráz

  47. PCR • Polymerázova řetezcová reakce • Umožňuje namnožení DNA z velmi malého množství

  48. PCR • Polymerázova řetezcová reakce • Komponenty PCR reakce jsou: • PCR primery • DNA polymerase (from Thermus aquaticus) • dNTPs • PCR instrument

  49. PCR • Polymerázová řetězová reakce • Cyklus: • 90°C – denaturace • 50°C – 60°C – nasedání primerů • 72°C – elongace • 90°C – denaturace 30x

More Related