Análisis de comunidades microbianas basadas en técnicas de cultivo.

1. ECOLOGÍA MICROBIANA Análisis de comunidades microbianas basadas en técnicas de cultivo. Análisis molecular de las comunidades microbianas. Medición de la actividad microbiana en la naturaleza. Dra. Flor Teresa García Huamán Dra. Flor Teresa García Huamán

2. La ecología microbiana trata de la interacción de los microorganismos entre sí y su ambiente.Los ecólogos microbianos se dedican principalmente a dos áreas de estudio. Dra. Flor Teresa García Huamán

3. La ecología microbiana tiene dos grandes objetivos: Dra. Flor Teresa García Huamán

4. I. ANÁLISIS DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS BASADOS EN TÉCNICAS DE CULTIVO Este proceso consiste en separar los organismos de interés de una comunidad microbiana, un procedimiento que se conoce como ENRIQUECIMIENTO, y que permite aislarlos después en un cultivo axénico. El aislamiento es importante por que se obtienen cultivos para estudios detallados y controlados de laboratorio y para su aplicación en biotecnología y microbiología ambiental e industrial. Dra. Flor Teresa García Huamán

5. ENRIQUECIMIENTO Y AISLAMIENTO En un ambiente natural no es frecuente encontrar un solo tipo de microorganismo. Lo que existe son comunidades microbianas, y el desarrollo de métodos y procedimientos que permitan el aislamiento y cultivo de microorganismos interés es un reto para el ecólogo microbiano. El enfoque más corriente para alcanzar este propósito es la TECNICA DEL CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO. Dra. Flor Teresa García Huamán

6. TÉCNICA DEL CULTIVO DE ENRIQUECIMIENTO Este método requiere que el medio de cultivo y las condiciones de incubación sean selectivos para el organismo que se desea aislar y contra selectivos para los organismos no deseados. Por tanto se necesita reproducir lo más fielmente posible los recursos y las condiciones que se dan en este nicho ecológico y buscar luego los habitantes potenciales de aquel hábitat capaces de desarrollarse en las condiciones de enriquecimiento seleccionadas. Dra. Flor Teresa García Huamán

7. Para que un cultivo de enriquecimiento tenga éxito es necesario contar con un inóculo apropiado (una muestra que contenga el microorganismo). Por tanto, la metodología del cultivo de enriquecimiento se inicia con la elección del hábitat adecuado. El cultivo de enriquecimiento suele establecerse sembrando el inóculo directamente en un medio altamente selectivo; muchos de los procariotas más frecuentes pueden aislarse de esta manera. Dra. Flor Teresa García Huamán

8. Por ejemplo, el microbiólogo holándesMartinusBeijerink, a quien se deben las primeras técnicas de cultivo de enriquecimiento, aisló por primera vez la bacteria fijadora de nitrógeno Azotobacterpor medio de lo que después se convirtió en una estrategia clásica de enriquecimiento. Como Azotobacter puede crecer rápidamente fijando N2 del aire, los medios de enriquecimiento carentes de amoniaco u otras formas de nitrógeno fijado son muy selectivos para este organismo; las bacterias no fijadoras de nitrógeno o las bacterias fijadoras de nitrógeno anaeróbicas son contra seleccionadas con este método. Dra. Flor Teresa García Huamán

9. Tanto el medio de cultivo como las condiciones de incubación son críticos para que tenga éxito un cultivo de enriquecimiento; es decir deben optimizarse tanto los recursos como las condiciones para tener las mejores posibilidades de enriquecer el microorganismo que interesa. Dra. Flor Teresa García Huamán

10. LA COLUMNA DE WINOGRADSKY Tradicionalmente, la columna de Winogradsky se ha utilizado en el cultivo de enriquecimiento para el aislamiento de bacterias fototróficas rojas y verdes, de bacterias sulfatoreductoras y de muchos otros anaerobios. El nombre corresponde al famoso microbiólogo ruso Sergei Winogradsky, quien utilizó la columna por primera vez a finales del siglo XIX para estudiar microorganismos del suelo. La columna de Winogradsky es un ecosistema anóxico en miniatura, que puede usarse como suministro a largo plazo de bacterias para cultivos de enriquecimiento. Dra. Flor Teresa García Huamán

11. La columna de Winogradsky se prepara con un cilindro de vidrio grande que se llena aproximadamente hasta la mitad con lodo rico en materia orgánica, y que preferiblemente contenga sulfuro. Los sustratos de carbono se mezclan previamente con el lodo; éstos determinarán que organismos serán enriquecidos, pero deben evitarse los sustratos fácilmente fermentables (que pueden llevar a una formación excesiva de gas). Al lodo se le añade CaCO3 y CaSO4 como tampón y como fuente de sulfato respectivamente. Dra. Flor Teresa García Huamán

12. El lodo se compacta en el envase, cuidando de no atrapar aire. El lodo se cubre con agua de un lago, embalse o acequia (o agua de mar si se prepara una columna marina), y se tapa el cilindro para evitar la evaporación. Se coloca el cilindro cerca de una ventana donde reciba luz solar atenuada y se deja durante varias semanas. Dra. Flor Teresa García Huamán

13. En una columna de Winogradsky típica se desarrolla una mezcla de organismos. Las algas y cianobacterias ocupan rápidamente la parte superior y al producir O2 ayudan a mantener esta zona óxica. El proceso de descomposición en el sedimento lleva rápidamente a la producción de ácidos orgánicos, alcoholes y H2, sustratos adecuados para las bacterias sulfato reductoras. Dra. Flor Teresa García Huamán

14. El sulfuro producido por las bacterias sulfato reductoras provoca el crecimiento de bacterias rojas y verdes del azufre. Estos organismos aparecen generalmente como zonas de crecimiento en el lodo de la columna, pero también pueden desarrollarse profusamente en el agua si los fotótrofosoxigénicos son escasos. Dra. Flor Teresa García Huamán

15. Para el muestreo de bacterias fototróficas de la columna se introduce una pipeta larga con la que se recoge un poco de lodo o agua coloreada. Estas muestras se pueden usar para microscopía y para inocular medios de enriquecimiento para aislamiento y caracterización. Dra. Flor Teresa García Huamán

16. SESGO EN EL ENRIQUECIMIENTO Aunque el cultivo de enriquecimiento es una herramienta poderosa, en muchos casos se produce un sesgo en el enriquecimiento. En los cultivos líquidos de enriquecimiento típicos, el organismo más adaptado a las condiciones escogidas puede convertirse en la población dominante. Desgraciadamente, el organismo mejor adaptado en los cultivos de laboratorio a menudo es sólo un componente minoritario del ecosistema microbiano, en lugar de ser el mayoritario o el más relevante desde el punto de vista ecológico. Dra. Flor Teresa García Huamán

17. El sesgo en el enriquecimiento puede demostrarse cuando se comparan los métodos de dilución con el clásico enriquecimiento en líquido. La dilución del inóculo seguida de un enriquecimiento a menudo da lugar a un organismo diferente que cuando se enriquece un inóculo sin diluir. Se cree que la dilución elimina aquellas poblaciones minoritarias pero de rápido crecimiento, dando de este modo la oportunidad de desarrollarse a otros miembros de la comunidad. Por tanto, la dilución del inóculo es una práctica común en el cultivo de enriquecimiento en la microbiología actual. Dra. Flor Teresa García Huamán

18. AISLAMIENTO EN CULTIVO AXÉNICO Los cultivos axénicos (o puros) se pueden obtener de muchas maneras a partir de un enriquecimiento; los métodos empleados más frecuentes son la siembra por estría en superficie (en placa petri), la siembra en profundidad (agarshake) y la dilución en líquido. Para aquellos microorganismos que crecen bien en medio de cultivo sólido (con agar), el método de elección es la siembra por estría. Dra. Flor Teresa García Huamán

19. A partir de una población mixta, mediante la siembra por estría se obtienen colonias separadas; repitiendo esta técnica con una de estas colonias aisladas se consigue un cultivo axénico, que puede ser transferido a un medio líquido. Las placas sembradas de este modo e incubadas en las condiciones adecuadas (por ejemplo en una jarra anóxica para anaerobios) nos permiten aislar tanto microorganismos aerobios como anaerobios. Dra. Flor Teresa García Huamán

20. SIEMBRA EN PROFUNDIDAD Y NÚMERO MÁS PROBABLE El método de siembra en profundidad consiste en la dilución de un cultivo mixto en tubos de agar fundido; cuando el agar solidifica, las colonias se desarrollan embebidas en el tubo de agar en vez de en la superficie, como ocurre en la siembra por estría en placa. Es un método de gran utilidad para purificar determinados tipos de microorganismos anaerobios, por ejemplo, las bacterias fototróficas del azufre y sulfato reductoras de las columnas de Winogradsky. Dra. Flor Teresa García Huamán

21. Es posible obtener cultivos axénicos mediante diluciones sucesivas de una suspensión de células en tubos de agar fundido. A partir de una colonia crecida en el tubo de mayor dilución utilizada como inóculo, se puede volver a hacer otro banco de diluciones, de tal manera que se acabe obteniendo un cultivo axénico. Dra. Flor Teresa García Huamán

22. Un procedimiento similar sin usar agar es la dilución seriada de un inóculo en un medio líquido hasta que el tubo o tubos finales de la serie no muestran crecimiento. Utilizando diluciones seriadas de diez en diez, por ejemplo, el último tubo que muestre crecimiento tiene que haberse originado a partir de 10 células o menos. Si se repite varias veces este proceso se obtienen cultivos axénicos. Esta técnica se conoce como la Técnica del Número Más Probable (NMP). Dra. Flor Teresa García Huamán

23. La Técnica del NMP se usa para estimar el número de microorganismos en alimentos, aguas residuales y en otras muestras donde hay que evaluar rutinariamente el número de células. Se puede hacer con medios altamente selectivos y condiciones de incubación dirigidos a uno o a un pequeño grupo de organismos, como por ejemplo un determinado patógeno, o usando un medio complejo para obtener una estimación del número total de células. Dra. Flor Teresa García Huamán

24. Con independencia del método utilizado para purificar el cultivo, una vez obtenido un supuesto cultivo axénico es esencial comprobar su pureza. Se utiliza para ello una combinación de técnicas microscópicas, observación de las características de la colonia en placas, o en siembras en profundidad en tubo, y comprobación del crecimiento en medios donde el microorganismo que nos interesa aislar crece muy poco, pero que favorecen el crecimiento de los microorganismos acompañantes. Dra. Flor Teresa García Huamán

25. La observación microscópica de un solo tipo morfológico de célula, junto con unas características uniformes de la colonia y ausencia de contaminación en test con diversos medios de cultivo, puede tomarse como prueba de que un cultivo es axénico (puro). Dra. Flor Teresa García Huamán

26. CULTIVOS AXÉNICOS DE ALTA TECNOLOGÍA: LAS PINZAS DE LÁSER Además de los métodos clásicos descritos, los avances tecnológicos han permitido la utilización de nuevas herramientas para la obtención de cultivos axénicos; una de ellas son las pinzas (ópticas) de láser. Las pinzas de láser consisten en un microscopio óptico invertido equipado con un laser infrarrojo enfocado con precisión y un instrumento de micro manipulación. Dra. Flor Teresa García Huamán

27. Una célula individual del campo de visión es atrapada por el haz de rayos laser y separada del resto de microorganismos. La célula queda atrapada por que la fuerza creada por el láser que empuja hacia abajo los objetos pequeños (como las células microbianas) y los mantiene en el lugar; cuando el haz de láser se desplaza, las células atrapadas se mueven junto con él. Si la muestra está en un tubo capilar, se atrapa una única célula que después se aísla rompiendo el tubo en un punto entre la célula y el resto de la población. La célula recogida se introduce entonces en un tubo pequeño de medio estéril para iniciar su crecimiento como cultivo axénico. Dra. Flor Teresa García Huamán

28. La tecnología de pinzas de láser es especialmente útil para el aislamiento de bacterias de desarrollo lento, que pueden ser superadas por el desarrollo rápido de otras poblaciones en los cultivos de enriquecimiento típicos, o para los organismos presentes en números tan bajos que podrían perderse con los métodos de enriquecimiento a partir de la dilución. Y junto con el uso de tinciones específicas capaces de identificar organismos determinados en un campo del microscopio, las pinzas de láser se emplean para seleccionar organismos a partir de una mezcla para su purificación y posterior estudio en el laboratorio. Dra. Flor Teresa García Huamán

29. II. ANÁLISIS MOLECULAR DE LAS COMUNIDADES MICROBIANAS Dra. Flor Teresa García Huamán

30. A.- VIABILIDAD Y CUANTIFICACIÓN MEDIANTE TÉCNICAS DE TINCIÓN • Tinción Fluorescente con DAPI. • Tinción de viables. • Anticuerpos fluorescentes. • Proteína fluorescente verde para el etiquetado celular. Dra. Flor Teresa García Huamán

31. 1.-Tinción Fluorescente con DAPI: Las tinciones fluorescentes se han usado mucho para teñir microorganismos en hábitats opacos. El colorante DAPI (4’,6-diamido-2-fenilindo) se utiliza con frecuencia para este propósito; las células teñidas con DAPI presentan fluorescencia azul brillante y son muy fáciles de ver y enumerar. La tinción DAPI se emplea para la enumeración de microorganismos en muestras clínicas, del ambiente y de alimentos. Dependiendo de la muestra, la tinción con colorantes fluorescentes no específicos puede representar un problema, pero el DAPI, que tiñe ácidos nucleicos, no suele reaccionar con la materia inerte. Dra. Flor Teresa García Huamán

32. Por tanto, para muchas muestras de suelo y agua, la tinción DAPI proporciona una estimación razonable del número de células presente. Para muestras acuáticas, las células se tiñen en la superficie de un filtro después de haber filtrado un volumen determinado de líquido. Estas técnicas sencillas tienen la ventaja de no ser específicas (tiñen todos los microorganismos de una muestra), pero con el inconveniente de que no diferencian entre células vivas y muertas, ni permiten el rastreo de organismos específicos en el ambiente. Dra. Flor Teresa García Huamán

33. 2.-Tinción de viables : Se ha desarrollado una tinción con colorantes fluorescentes que diferencia entre células vivas y muertas. Esto proporciona información no sólo del número de organismos de una muestra sino también de su viabilidad. Esta distinción se basa en la integridad de la membrana citoplasmática celular. A la muestra se añaden dos colorantes, verde y rojo; el colorante fluorescente verde penetra en todas las células, viables o no, mientras que el rojo, que contiene yoduro de propidio, penetra sólo en aquellas células cuya membrana ya no se encuentra intacta y por tanto, están muertas. Dra. Flor Teresa García Huamán

34. Las células verdes estaban vivas y las rojas muertas, lo que ofrece una evaluación instantánea de la viabilidad.Este método se utiliza con cultivos bacterianos de laboratorio, pero no es adecuado para el examen microscópico de hábitats naturales debido a problemas de tinción inespecífica de los materiales inertes. Dra. Flor Teresa García Huamán

35. 3.-Anticuerpos Fluorescentes: Las técnicas de tinción con sustancias fluorescentes pueden hacerse más específicas con el empleo de anticuerpos fluorescentes. La gran especificidad de los anticuerpos frente a los constituyentes de la superficie de un organismo particular puede explotarse para identificar o rastrear un organismo en un hábitat complejo; por ejemplo, suelo o una muestra clínica que contenga una mezcla de muchos organismos. Dra. Flor Teresa García Huamán

36. El método requiere la preparación de anticuerpos específicos contra los organismos que interesan, lo cual es largo y laborioso. Sin embargo, para el caso de microorganismos de importancia clínica, se dispone comercialmente de anticuerpos de alta especificidad. Dra. Flor Teresa García Huamán

37. 4.-Proteína Fluorescente Verde para el Etiquetado Celular: En el genoma bacteriano se puede insertar un gen que codifica una proteína fluorescente verde (GFP, greenfluorecensprotein). Al expresarse, las células que contienen la GFP aparecen de color verde cuando se observan con un microscopio de luz ultravioleta. Aunque no resulta útil para el estudio de poblaciones naturales (por que estas células carecen del gen GFP), las células etiquetadas con GFP se pueden introducir en un medio, como las raíces de las plantas y seguir con el microscopio la cepa etiquetada. Dra. Flor Teresa García Huamán

38. Con este método los ecólogos microbianos pueden estudiar in situ la competencia microbiana entre la microbiota nativa y la cepa con GFP introducida o evaluar el efecto de la perturbación en el ambiente. La GFP también se ha usado ampliamente en cultivos de laboratorio como gen “indicador”. Dra. Flor Teresa García Huamán

39. B.- TINCIONES GENÉTICAS Dra. Flor Teresa García Huamán

40. 1.-TINCIÓN FILOGENÉTICA CON HIBRIDACIÓN FLUORESCENTE IN SUTU : Los colorantes filogenéticos son oligonucleotidos fluorescentes complementarios en la secuencia de base a las secuencias en el ARNr 16s o 18s. Los colorantes filogenéticos penetran en la célula, donde hibridan con el ARNr directamente en los ribosomas. Como se han identificado sondas filogenéticas para especies microbianas individuales, así como para dominios enteros de organismos, el grado de especificidad de un colorante filogenético puede controlarse mediante la secuencia de la sonda fusionada. La FISH permite identificar o rastrear un organismo particular o un grupo de organismos relacionados, dependiendo de la especificidad de la sonda. Dra. Flor Teresa García Huamán

41. 2.-TINCIÓN DE CROMOSOMAS Y TRANSCRIPCIÓN INVERSA IN SUTU: La tinción de cromosomas se emplea para identificar genes específicos de la microbiota de muestras naturales, mientras que la transcripción se dirige a un ARNm específico (es decir genes expresados). La tinción de cromosomas se inicia con el marcado fluorescente de una sonda de oligonucleótidos o del gen completo, de un conjunto de genes, o incluso de un genoma completo digerido para obtener sondas pequeñas. Las sondas se utilizan para averiguar que organismo(s) de una muestra contiene(n) el gen o los genes presentes en las sonda(s). Dra. Flor Teresa García Huamán

42. La tinción de cromosomas es útil para identificar bacterias que contienen genes específicos, como los que codifican la nitrogenasa (responsable de la fijación del nitrógeno), los componentes del centro de reacción fotosintético, o vías autotróficas específicas. Los números de células fluorescentes en cada caso darían una estimación de las bacterias fijadoras de nitrógeno, fotótrofas o autótrofas, respectivamente, en una muestra natural. Dra. Flor Teresa García Huamán

43. A diferencia de la técnica anterior, la transcripción inversa in situ, busca si un organismo está expresando un gen o genes determinados en la naturaleza en un momento determinado.El método utiliza una sonda que hibrida con un ARNm específico previamente transcrito por las células en una muestra. Una vez que la sonda reacciona, tiene lugar la transcripción inversa, produciendo un ADN complementario que es amplificado por la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Finalmente, el ADN amplificado reacciona con una sonda fluorescente. Dra. Flor Teresa García Huamán

44. C.- PCR: RELACIONANDO GENES ESPECÍFICOS CON ORGANISMOS ESPECÍFICOS. Muchos estudios en ecología microbiana no necesitan aislar los microorganismos, ni siquiera identificarlos por microscopía con las tinciones antes descritas. Generalmente, el objetivo de un estudio es evaluar la biodiversidad de un hábitat sin emplear técnicas de cultivo, ni observar células. Con este objetivo, se han aislado y caracterizado genes específicos como medida de la biodiversidad de la comunidad microbiana. Como los genes específicos están ligados frecuentemente a organismos específicos la detección del gen implica la presencia del organismo. Dra. Flor Teresa García Huamán

45. Las principales técnicas en este tipo de análisis microbiano son: Dra. Flor Teresa García Huamán

46. III. MEDICIÓN DE LA ACTIVIDAD MICROBIANA EN LA NATURALEZA Cualquier medición de la actividad microbiana (reducción de sulfato, fotosíntesis, respiración etc.) en una muestra natural es una estimación colectiva del conjunto de la comunidad microbiana. Dra. Flor Teresa García Huamán

47. GRACIAS Dra. Flor Teresa García Huamán