PASJONUJ Ą CA ZAGADKA SELENOCYSTEINY Selen – pierwiastek śla dowy

1. PASJONUJĄCA ZAGADKA SELENOCYSTEINY • Selen – pierwiastek śladowy • niedobór Se prowadzi do kretynizmu w wyniku niedoboru aktywności hormonów tarczycy. • Selen występuje w postaci selenocysteiny w centrum aktywnym wielu enzymów prokariotycznych i eukariotycznych. Uczestniczy w reakcjach redoks. • Dwa najistotniejsze znane selenoenzymy eukariotyczne to: • peroksydaza glutationowa • dejodynaza • U człowieka poznano 19 selenoprotein

2. Enzymy zawierające selen Peroksydaza glutationowa redukuje cytotoksyczne nadtlenki. Dejodynaza redukuje tetrajodotyroninę (tyroksynę) do trijodotyroniny. Dygresja: Przez wiele lat uważano, że tyroksyna jest głównym hormonem tarczycy, gdyż jej poziom w osoczu jest wyższy od innych pochodnych. Jednak komórki 10x silniej odpowiadają na trijodotyroninę.

3. Skąd się bierze selenocysteina w łańcuchu białkowym? Pierwsze przypuszczenie: analogicznie do hydroksylizyny lub hydroksyproliny - przez potranslacyjną modyfikację – FAŁSZYWE. Selenocysteina (Sec) zostaje wbudowana do łańcucha polipeptydowego podczas translacji. Selenocysteina jest 21 aminokwasem białkowym!

4. Jaki jest więc kodon dla selenocysteiny? Doświadczenie: Porównano sekwencje aminokwasowe białek zawierających selenocysteinę z sekwencją nukleotydową ich mRNA. Wynik: ???? Selenocysteina jest kodowana przez.... UGA Jak to jest możliwe, że UGA pełni podwójną funkcję: kodonu dla selenocysteiny i kodonu stop? Hipoteza postawiona na podstawie badań porównawczych: początkowo (w ewolucji) tylko UAA i UAG były kodonami stop a UGA był kodonem selenocysteiny. Dopiero później UGA zaczął pełnić podwójną rolę.

5. Mechanizm wbudowywania selenocysteiny do łańcucha polipeptydowego  Lepiej poznany u Prokaryota. Dzięki istnieniu mutantów poznano 4 geny i ich produkty odpowiedzialne za proces wbudowywania selenocysteiny. Istnieje „specjalny” tRNA wprowadzający selenocysteinę do rybosomu. Ale ten tRNA wcale nie wiąże selenocysteiny lecz serynę!

7. Jak Sec-tRNA odnajduje właściwy UGA? • Czy decyduje o tym jakaś informacja zawarta w mRNA? TAK! • Prokaryota: badano sekwencję nukleotydową i strukturę mRNA kodujących białka zawierające selenocysteinę znajdowanospecyficzną strukturę – SECIS. • We wszystkich prokariotycznych mRNA element SECIS występowałtuż za UGASec • (czyli w obrębie odcinka mRNA ulegającego translacji). • U Eukariota również występują struktury SECIS, ale umiejscowione są poza ramką odczytu. Są zawsze w dość znacznej odległości od UGASec(111 z – 2,7 kz). • Przesunięcie tej struktury (inżynieria) bliżej UGASec znosi jej funkcję i UGA jest • odczytywany jako stop.

8. Eukariotyczne sekwencje SECIS Chapple C E et al. Bioinformatics 2009;25:674-675

9. Białko SEL B to klasyczny czynnik elongacyjny • Jest homologiem EF-Tu; jego aktywność zależy od GTP. • Tworzy kompleks: Sec-tRNASecSEL BGTP i wprowadza Sec-tRNASecdo rybosomu. • Musi rozpoznawać: • Sec-tRNASec • Miejsce A rybosomu • SECIS

10. SBP2 – SECIS binding protein 2

11. Jak to się dzieje, że czynniki terminacji (RF) nie rozpoznają UGAsec jako sygnału stop?  • CZASEM ROZPOZNAJĄ!!!  • Jeśli w komórce jest dostatecznie dużo selenu to tworzy się kompleks • Sec-tRNASecSELBGTP. • Ten kompleks ma wyższe powinowactwo dootoczenia UGAsecniż RF-2 (SECIS • przeszkadza w oddziaływaniu RF a pomaga w oddziaływaniu SEL B). • W przypadku niedoboru selenu nie tworzy się kompleks Sec-tRNASecSELBGTP i RF (RF-2 lub eRF-1) może wtedy oddziaływać z • UGAsec. Powstają „krótsze” białka (przy braku • selenu, te białka i tak nie spełniałyby swej funkcji).

12. UGAsecC Czteroliterowy kodon stop a wbudowywanie selenocysteiny E.coli: UGAU – wydajny terminator – ma wysokie powinowactwo do RF2 UGAC – mało wydajny terminator – ma stosunkowo niskie powinowactwo do RF2 Jaki będzie kolejny nukleotyd po sekwencji UGAsec?

13. EUKARYOTA: UGA puryna – wydajny terminator – wysokie powinowactwo do eRF1. UGA pirymidyna – mało wydajny terminator – stosunkowo niskie powinowactwo do eRF1. Większość enzymów selenowych (ale nie wszystkie!) ma sekwencję UGA pirymidyna Dlaczego nie wszystkie? Które mają sekwencję UGAsec pirymidyna, a które UGAsec puryna? Hipoteza: mechanizm regulatorowy Kluczowe enzymy selenowe mają UGAsecpirymidyna. Przy częściowym niedoborze selenu selenocysteina będzie wbudowywana głównie w kluczowe a nie „po trochę” we wszystkie enzymy selenowe.

14. 60% stanowi forma obejmująca cały ORF 30% stanowi forma najkrótsza

15. Czy to koniec niespodzianek? • W 2002 roku pojawiło się doniesienie o 22 białkowym aminokwasie. • Aminokwas znaleziony w jednym białku: metylotransferazie metyloaminowej, ale we wszystkich gatunkach bakterii Metanosarcinaceae (należących do Archebacteria) oraz u Desulfitobacterium hafniense • Bakterie te wykorzystują metyloaminy jako źródło energii • Kodowany przez UAG

16. W mRNA tej metylotransferazy znaleziono strukturę podobną do struktury SECIS. Nazwano ją PYLIS. Struktura ta pomaga w odróżnieniu UAG znaczącego „wbuduj pirolizynę” od UAG znaczącego STOP, ale nie jest bezwzględnie konieczna. • Istnieje specyficzny tRNA (antykodon komplementarny do UAG) przenoszący pirolizynę oraz specjalna syntetaza pirolizylo-tRNA. Pirolizyna jest syntetyzowana z wolnej lizyny. • EF-Tu może przenosić Pyl-tRNAPyl do rybosomu • Obecnie znamy 34 białka bakteryjne o aktywności metylotransferazy metyloaminowej zawierające pirolizynę. Pirolizyna jest istotna dla ich aktywności enzymatycznej. Pirolizyna występuje także w sekwencji enzymu transferazy guanylilowej tRNAHis (Methanosarcina acetivorans), gdzie nie jest istotna dla aktywności enzymatycznej.

17. Mechanizm kontroli jakości mRNA. Prowadzi do degradacji tych mRNA, w których w wyniku mutacji w genie lub w wyniku błędu w trakcie splajsingu pojawił się dodatkowy kodon stop („in-frame” czyli w sekwencji zgodnej z ramką odczytu). Dotyczy też genów TCR i Ig, w których doszło do nieproduktywnej rearanżacji. NMDNonsence-Mediated mRNA Decay • Jaka byłaby konsekwencja translacji na takim mRNA? • Powstawałyby: • białka niefunkcjonalne (loss-of-function) • białka o dodatkowej funkcji (gain-of-function) • białka hamujące funkcjonowanie prawidłowych białek (dominant-negative)

18. W jaki sposób rozpoznawane są przedwczesne kodony STOP? Niektóre badania wiążą mechanizm NMD z istnieniem kompleksów EJC (exon junction complex).

19. EJC – kompleks wielu białek o zmiennym składzie. Dla NMD istotne m.in.: Y14/MAGOH, PYM, eIF4AIII, UPF3. Do kompleksu EJC dołącza w cytoplazmie UPF2. UPF - ang. up-frameshift

20. Pierwsza runda translacji (the pioneer round) to runda sprawdzająca jakość mRNA Kompleks inicjatorowy buduje się poprzez CBC a nie przez CBP (eIF4E). Rybosom podczas translacji powoduje oddysocjowanie kolejnych kompleksów EJC. Jeśli jednak spotka kodon STOP, za którym pozostaje jeszcze jakiś EJC to dochodzi do degradacji mRNA.

21. UPF1 (związany z rybosomem) • oddziałuje z UPF3 – stanowi pomost • pomiędzy rybosomem a EJC. • SMG1 fosforyluje UPF1 • RF1 i RF3 oddysocjowują od rybosomu • Do UPF1 wiąże się SMG7 • SMG7 kieruje mRNA do ciałek P • Inne scenariusze też są możliwe (np. SMG6 też oddziałuje z UPF1, jest endonukleazą)

22. Non-Stop Decay (NSD) Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2007, 8, 113

23. tmRNA • ma cechy zarówno tRNA jak mRNA (stąd nazwa) • inne nazwy: SsrA RNA (small stable RNA A), 10Sa RNA • występuje tylko u Prokaryota • funkcja – przeciwdziałanie skutkom translacji na mRNA zdegradowanych od 3’ końca • Jakie byłyby to skutki? Brak kodonu stop  brak możliwości działania czynników uwalniających  zatrzymanie łańcucha białkowego i mRNA w rybosomie  zablokowanie funkcjonowania rybosomów.

24. Obserwacje i doświadczenia: Często bakterie transformowane plazmidem zawierającym gen białka eukariotycznego nie produkują wydajnie tego białka (ciałka inkluzyjne). W ciałkach inkluzyjnych znaleziono fragmenty transgenicznego białka - wszystkie miały prawidłowy N-koniec, były różnej długości, a na C-końcu miały sekwencję ANDENYALAA niekodowaną przez transgen. Inna obserwacja: sekwencja YALAA jest w białkach bakteryjnych „znacznikiem” do proteolizy. Wszystkie poniżej zamieszczone rysunki pochodzą z pracy: Nature Structural Biology. 2000, (6):449-55. The SsrA-SmpB system for protein tagging, directed degradation and ribosome rescue.Karzai AW, Roche ED, Sauer RT.

25. tRNAAla tmRNAAla A N D E N Y A L A A - stop

26. Z jakimi białkami oddziałuje tmRNA? • Fragment „t” tmRNA przypomina najbardziej tRNAAla. • tmRNA oddziałuje z syntetazą alanylo-tRNA. Powstaje alanylo-tmRNA • alanylo-tmRNA oddziałuje z EF-Tu•GTP. Zostaje wprowadzony do miejsca A rybosomu tak, jak każdy aa-tRNA • alanylo-tmRNA oddziałuje z białkiem SmpB. To oddziaływanie jest konieczne dla funkcjonowania tmRNA. • SmpB (small protein B) – mechanizm jego działania jeszcze niewyjaśniony. U mutantów smpB nie zachodzi proces trans-translacji.