第一章 发酵菌种的选育

1. 上海师范大学 生命与环境科学学院 生物技术专业 第一章 发酵菌种的选育

2. 一、发酵菌株的分离和筛选 • 1、常用的发酵菌种 • 细菌 • 醋杆菌属的醋化醋杆菌、弱氧化醋杆菌 • 乳酸杆菌 • 枯草杆菌 • 丙酮丁醇梭菌 • 大肠杆菌 • 谷氨酸棒状杆菌

3. 放线菌 • 链霉菌属 • 小单孢菌属 • 地中海诺卡氏菌 • 米苏里游动放线菌

4. 酵母菌 • 酿酒酵母 • 假丝酵母属 • 产朊假丝酵母 • 解脂假丝酵母 • 热带假丝酵母 • 毕赤酵母属、汉逊酵母属

5. 霉菌 • 曲霉属 • 米曲霉 • 黑曲霉 • 青霉属 • 青霉菌：点青霉、产黄青霉 • 桔青霉 • 根霉属 • 德氏根霉 • 米根霉、小麦曲根霉 • 红曲霉属 • 紫红曲霉

6. 2、发酵菌种获得的一般途径 • (1）微生物保藏单位获取 • (2）自然界分离 • (3）野生菌株诱变 • (4）基因重组 • (5）动植物细胞

7. 3、 发酵菌种的基本要求 • ①能在廉价原料上快速生长； • ②生长条件易于掌控； • ③对设备和操作方式适应性强； • ④菌株生产性能稳定性强； • ⑤产物产量高，积累浓度高； • ⑥产物的回收容易； • ⑦抗杂菌、抗噬菌体能力强； • ⑧菌体不是病原菌。

8. 4、菌株的分离和筛选 • （1）菌株分离（separation）：将样品中混杂的各种微生物通过分离技术区分开的过程； • （2）筛选（screening）：从多株具备一定特征菌群中选择出符合标准的菌株的过程。 • 通常，分离中的一些措施本身就具有筛选作用。筛选又是通过分离而实现的。

9. （3）菌种分离的一般过程 调查研究（包括资料查阅） 试验方案设计 含微生物样品的采集（如何使样品中含所需微 生物的可能性大） 样品预处理（如何在后续的操作中使这种可 能性实现） 菌种分离

10. 根据目的菌株及其产物特点分 选择性分离方法 随机分离方法 (定向筛选←选择压力)(用筛选方案- 检测系统进行间接分离） 富集液体培养 固体培养基条件培养 (初筛) 菌种纯化 复筛

11. 菌种纯化 初步工艺条件摸索 再复筛 生产性能测试 较优菌株1-3株 保藏及进一步做生产试验 某些必要试验和 或作为育种的出发菌株 毒性试验等

12. 采样时应注意的问题: • 土壤微生物的分布 • 采土深度 • 土壤植被情况 • 采样季节 • 土壤的酸碱度 • 样品的预处理 • 物理方法：热处理；膜过滤法；离心法 • 化学方法 • 诱饵法

13. 选择性分离原理和技术 • 生长条件的选择与控制原理 • 控制营养成分 • 控制培养基酸碱度 • 添加抑制剂 • 控制培养温度 • 控制通气条件 • 选择性分离技术 • 富集液体培养技术 • 固体培养技术

14. A B μ S0 A.富集液体培养 • 增加混合菌群中所需菌株数量的一种技术 • 技术特点：给混合菌群提供一些有利于目的菌株生长或不利于目的菌以外的其他菌型生长的条件 • 培养方式 • 分批培养方式：以最大比生长速率 （μmax）筛选，存在选择压力的控制、移种时间和次数等问题 • 连续培养方式：以比生长速率（ μ）筛选 基质浓度对A、B两种菌的比生长速率（μ）的影响 当S<S0时，富集什么菌株？ 当S>S0时，富集什么菌株？

15. B. 固体培养技术 • 常用于分离某些酶产生菌 • 选择压力：在选择培养基中加入所需酶的基质 随机分离原理与技术 • 从产物入手，通过设计高产培养基和建立快速灵敏专一的筛选方法，从随机分离的菌落中筛选出所需的目的菌。 • 技术关键：产物合成条件的选择与控制及相应筛选方法的确定。

16. “菌落纯” 与“菌株纯” • 纯种分离 A、划线分离法 B、稀释分离法 C、显微操纵仪

17. 形态筛选模拟图 纸片显色模拟图 变色圈实验照片 快速筛选方法简介 变色圈筛选法 谷氨酸产生菌时，加入溴百里酚蓝，pH在6.2以下时为黄色，pH7.6以上为蓝色。 形态筛选法 如：VB2生产菌株筛选。 纸片显色法 如：柠檬酸生产工艺菌；乳酸生产菌

18. 透明圈模拟图 生长圈模拟图 抑菌圈照片 生长圈筛选法 生长圈法通常用于分离筛选氨 基酸、核苷酸和维生素的产生菌。 透明圈筛选法 如：脂肪酶、淀粉酶、蛋白酶产生菌 抑菌圈筛选法 常用于抗生素产生菌的分离筛选。

19. 复筛 初筛: 选出10-20%的较好菌株 选出3—5个较好的菌株 摇瓶培养筛选法

20. 菌株性能鉴定 • 1）微生物生物学特征的初步鉴定； • 2）产物的定性或定量分析 ； • 3）前期评价（生长特性、毒性、效价、稳定性等）； • 4）工艺指标试验（培养液粘度、菌体聚集度等）。

21. 目的菌落进行液体培养，对产物进行定量测定 筛选产物含量高的菌株 举例：氨基酸产生菌的筛选 样品 预处理   初筛（除真菌） 在分离平板上生长获得多个单菌落 复印平板（copy 法，对应到copy前相应位置，找到目的菌落） 平板培养，其中有产生氨基酸的菌落分泌氨基酸 u.v线杀死长好的菌落 再铺上一层含营养缺陷型试验菌的琼脂 培养后 产氨基酸菌落周围有生长圈

22. 乳酸菌分离 取未成熟的酱醪样品1g至无菌磨口瓶中   加麦芽汁至瓶口处，封塞，25℃培养24-48h 培养基中长出绢丝状波动物，镜检 杆状，阳性染色 初步断定乳酸菌   用选择性培养基分批富集培养2-3代 稀释分离法分离单菌落，培养基为含麦芽汁、CaCO3的琼脂培养基  根据透明圈挑选菌落   性能测定（镜检杆状，染色阳性；乳酸纸层析鉴定） Rf值定性 （有机酸呈黄斑点）    乳酸生成量测定（滴定法）

23. 产链霉素放线菌菌种分离（从退化菌种中筛选）产链霉素放线菌菌种分离（从退化菌种中筛选） 取工业发酵液（含孢子）样品1环 放入带玻璃珠的装有10ml 无菌水的小三角瓶中，摇匀 采用稀释法制平板，获取单菌落 斜面保藏 高产菌恢复 根据高产菌的特点，选择目的菌落 放大培养，发酵液性能测试

24. 啤酒酵母的分离 取发酵液少许以10倍稀释成10-1-10-7 稀释分离法 取0.1ml 加入固体培养基铺平皿（×2）   在麦芽汁固体培养基上，25℃培养48-72h 形态筛选 根据正常株特点进行挑选，接种斜面备用   纯化，采用平板分离法进一步纯化，至少反复三次 ①生成子囊孢子速度测定 ②发酵力测定 性能测定 ③热死温度测定 ④凝集力测定 ⑤双乙酰含量测定

25. 多糖产生菌的筛选 • 取样特点：碳水化合物工业的废弃物 • 筛选方案：从菌落外观判断，选择外观呈粘液状的菌落，然后根据液体培养测定多糖含量来筛选高产菌。

26. 二、菌种的选育 • 1、选育的基本思路 • 运用遗传学原理和技术对现有的菌株进行的多方位的基因选择和改造，使现存的优良性状得以保持或强化，除不良性状或增加新的性状。

27. 2、菌种选育的目标 (1) 提高有效产物的产量 解除代谢途径中的限速步骤（增加特定基因的拷贝数，增加相应基因的表达能力）； 绕过代谢途径中的限速步骤（在代谢途径中引伸出新的代谢步骤，由此提供一个旁路代谢途径）； 增加前体物的浓度； 减少无用副产品的生成； 提高菌种对高浓度的代谢产物的耐受力。…… eg:Streptomyces hygroscopicus经连续10代选育产麦迪霉素单位从20U/mL– 4500UmL ，有效组分从40%---75%。

28. (2) 改善菌种特性，提高产品质量 eg:Penicillium chrysogenum NRRL 1951（杂色低产），Wisconsin Q176（杂色高产），DL3D10（无色高产）; (3) 简化工艺条件 例如：孢子生长能力选育可以减少种子工艺难度；少泡突变株可提高反应器利用率，抗噬菌体菌株、黏性小菌株、低呼吸强度菌株、低发酵热菌株…… (4) 开发新品种 例如：柔红霉素生产菌诱变出阿霉素生产菌，四环素生产菌——去甲基金霉素菌，新霉素生产菌——链霉胺生产菌

29. 3、菌种选育手段 （1）自然选育：菌种管理的常规手段。 常规育种技术 育种 代谢工程育种技术 （2）诱变育种：提高菌种产量、性能的重要手段。

30. 选出200株 选出50株 选出5株 诱变 40株 40株 40株 40株 40株 诱变 初筛 复筛 1株 1株1瓶 1株4瓶 选出50株 选出5株 初筛 复筛 1株1瓶 1株4瓶 诱变育种步骤 • 出发菌株的选择 • 处理菌悬液的制备 • 诱变处理 • 中间培养 • 分离和筛选

31. 淀粉 Glu AMP F-6-P ATP ADP P ATP F-1,6-2P NH4+ 磷酸二 羟丙酮 3-磷酸 甘油醛 磷酸烯醇式丙酮酸 ADP K+ ATP 丙酮酸 乙酰CoA 柠檬酸 草酰乙酸 Fe2+ 异柠檬酸 苹果酸 乙醛酸 FADH2 α-酮戊二酸 激活 抑制 琥珀酰CoA 谷氨酸 GTP • 举例:谷氨酸发酵菌种选育 ATP

32. 谷氨酸生产菌细胞通透性机理

33. 赖氨酸生产菌种的选育

34. 育种思路 • 出发菌株：黄色短杆菌、谷氨酸棒杆菌、乳糖发酵短杆菌 • 1.优先合成的转换——渗漏缺陷型的选育 • 2.切断支路代谢——营养缺陷型的选育：高丝氨酸缺陷型 • 3.抗结构类似物突变株的选育：AEC • 4.解除代谢互锁：Leu- 、抗Leu结构类似物、 喹啉s、 苯醌s • 5.增加前体物的合成和阻塞副产物的生成： Ala-、抗Asp结构类似物 选育适宜的CO2固定酶/TCA循环酶活性比突变株 • 6.改善细胞膜的透过机能 • 7. 选育温度敏感突变株 • 8. 应用细胞工程和基因工程育种

35. （3）基因育种

36. （4）原生质体育种 原生质体融合育种步骤 1）标记菌株的筛选和稳定性验证； 2）原生质体制备； 3）等量原生质体加聚乙二醇促进融合； 4）涂布于再生培养基，再生出菌落； 5）选择性培养基上划线生长，分离验证，挑取融合子进一步试验、保藏； 6）生产性能筛选。

37. 三、菌种的保藏 • 1、常见菌种的保藏方法 • （1）酵母菌：斜面低温保藏法（曲汁或麦芽汁）3-6月移植一次； • （2）曲霉菌：斜面低温保藏法（易变异）；砂土保藏； • （3）真菌：只产菌丝不产孢子的，可采用液氮保藏； • （4）细菌与放线菌：冷冻干燥或砂土保藏。

38. 2、菌种保藏管理 • （1）活力测定 • 包括菌种存活力、纯度及理想性状的测定。 • （2）培养记录 • 防水墨水记录标签。（内容包括：收藏单位、菌株来源、菌株名称、菌株分类、存放日期、产品及产量、致病性或许可状况、培养条件、分离方法、适合培养基范围、保藏方法） • （3）螨虫的防止 • 经常保持工作台清洁并用杀螨剂擦洗。有螨的培养物应密封进行灭菌。 • （4）操作安全防护 • 应注意：病原体、干燥剂、液氮等的防护。

39. 3、菌种保藏机构 • （1）国内的菌种保藏中心 • 1979年7月：成立中国微生物菌种保藏管理委员会（CCCCM） • 下设几个中心： • 1）中国工业微生物菌种保藏管理中心（China Center of Industrial Culture Collection,CCICC)：负责全国工业生产与研究应用微生物菌种的收集、鉴定、保藏与供应等职责。现藏工业微生物菌种1750余株。

40. 2）林业微生物菌种保藏中心 • 1985年成立，由林科院负责，侧重林业微生物的菌种保藏，现保藏菌种690余株； • 3）中国科学院典型培养物保藏管理中心（CCTCC） • 1996年成立，下设9个库：中国普通微生物保藏管理中心（CGMCC）； 中国病毒保藏中心（CCGVCC）； 细胞库； 昆明细胞库； 基因库；植物离体种质库； 稀有濒危特有植物种质库； 海洋生物种质库。 现藏培养物16000个株系，其中菌株13000株。

41. （2）国外著名菌种保藏机构 • 1）美国典型菌种保藏中心（ATCC） • 位于马里兰州，现藏细菌8000株，丝状真菌4400株，酵母菌606株及其他菌种千余株。保藏方法主要以冷冻干燥和液氮超低温冻结法。 • 2）荷兰真菌中心收藏所（CBS） • 位于荷兰巴尔恩市，现藏细菌1000株，丝状真菌13000株，酵母菌3500株。

42. 3）英国的国立标准菌种收藏所（NCTC） • 英联邦真菌研究所（CMI） • 4）冷泉港研究室（CSH） • 美国 • 5）日本东京大学应用微生物研究所（IAM） • 6）日本大阪发酵研究所（IFO） • ……等等

43. 第一次作业: • 1、网络搜索2-3例利用微生物大规模表达的产品的资料, 并简要描述此菌种的生物学特点？ • 2、以从自然界分离筛选纤维素酶生产菌为例，阐述如何保证在操作过程中使目的菌株获得的可能性最大？ • ------2周后在作业本上书面交上-------