Strategie di difesa con agenti di biocontrollo in pre - e post- harvest …

1. Strategie di difesa con agenti di biocontrollo in pre- e post-harvest … … contro la «fumaggine» causata da Alternariaspp. Moruzzi Serena, Martini Marta Università degli Studi di Udine, DISA

2. Presentazione del problema 2000: prime segnalazioni in FVG di alterazioni della buccia delle mele in campo e in ambiente di conservazione Osservazione dei sintomi Presenza di fumaggine Diagnosi di routine Indagini fitopatologiche (stereomicroscopio e isolamento) Presenza di agenti fungini

3. Presentazione del problema • 2008: • Università di Udine, DISA (p.a. Borselli S., prof. Osler R., dott. Grisan S., dott. Poggetti L.) • Agenzia Regionale per lo Sviluppo Rurale (dott. Benvenuto L., dott. Malossini G., dott. Frausin C.) • FriulFruct(dott. Zampa C.) • hanno iniziato progetto di ricerca sulla malattia: • Ricerca bibliografica • Sintomatologia e diffusione della malattia: campo e ambiente di conservazione • Eziologia della malattia (identificazione agente/i patogeno/i): isolamento microrganismi e loro identificazione, postulati di Koch • Individuazione strategia di lotta/controllo: chimico • biologico

4. 1. Ricerca bibliografica • Problematiche simili (malattie epifitiche) risultavano comuni nelle zone temperate e umide: diffuse in gran parte degli Stati Uniti, Europa (Olanda, Norvegia, Germania, Slovenia, Serbia, Polonia), Turchia, Giappone, Cina, Brasile • In Italia segnalazioni in Trentino Alto Adige, Piemonte, Emilia Romagna e Friuli Venezia Giulia (Lindner, 2009; Grosso et al., 2011) Malattia Agenti causali • - Gloeodespomigena(Schweinitz, 1832) • - Peltasterfructicola(Johnson et al., 1997) • - Leptodontiumelatius(Johnson et al., 1997) • Geastrumiapolystigmatis(Johnson et al., 1997) • 80 nuove presunte specie (anni 2000), tra cui: • Tripospermumspp. (Grabowski, 2007); • Microcyclosporaspp., Stomiopeltisspp., Microcyclosporellaspp. (Gleasonet al., 2011) • Classe Dothideomycetes, ordine Capnodiales (95%) Sootyblotch(maculatura fuligginosa)

5. 1. Ricerca bibliografica Malattia Agenti causali Flyspeck(macchiolina di mosca) • Schizothyrium pomi (Von Arx , 1959) • Zygophialajamaicensis(Mason, 1945) • 10 nuove presunte specie (anni 2000), tra cui: • Ramulariaspp., Dissoconiumspp. (Gleasonet al., 2011) White haze(patina bianca) - Tilletiopsisspp. (Boekhoutet al., 2006)

6. 2. Sintomatologia Tipica delle malattie epifitiche (fumaggini) che si sviluppano a spese degli strati più superficiali e inerti del frutto: • Striature diffuse sulla maggior parte della superficie del frutto, concentrate soprattutto (colore nero più intenso) nei dintorni della base del peduncolo e della depressione calicina; frequentemente sembrano descrivere il percorso di un percolamento, probabilmente in corrispondenza dei punti in cui si è trovata a scorrere acqua piovana o di condensa e quindi l’organismo si è sviluppato maggiormente in concomitanza di tali zone, più ricche d’acqua

7. 2. Sintomatologia • Iniziale opacizzazione degli strati superficiali, che evolve in un annerimento consistente, causato dalla maturazione e sporulazione del micelio fungino • Odore organico caratteristico • Nessuna lesione o distruzione dei tessuti (no rugginosità) • Interferenza sul normale sviluppo dei frutti (caratteristiche organolettiche) • I sintomi si evidenziano soprattutto su Golden Delicious, ma risultano sintomatiche anche altre cultivar (Golden Lasa, Gold Rush, Brina, Summerfree)

8. 2. Sintomatologia In genere si riscontra in cella di conservazione: • Durante la conservazione in cella frigo, sia in atmosfera controllata (ULO) che non, in condizioni di elevata umidità relativa, i sintomi si manifestano in maniera evidente • Le mele sintomatiche nei bins sono disposte in ordine sparso e non come tipicamente avviene per le malattie da conservazione (infezione che inizia in campo) • A volte (sulla base dell’andamento stagionale) è possibile riscontrare i sintomi iniziali già in campo, nel periodo estivo Mela sintomatica in campo Bins con mele sintomatiche Mela sintomatica in conservazione

9. 2. Sintomatologia • Si è potuto osservare una maggiore diffusione della malattia: • nelle annate con lunghi periodi piovosi in primavera, seguiti da estati calde • in caso di presenza di fitta copertura fogliare • sui frutti sviluppatisi nella parte bassa della pianta

10. 2. Sintomatologia

11. 2. Diffusione della malattia • Valutazione dei sintomi presenti su mele in campo e in cella di conservazione al fine di stabilire: • l’influenza della tipologia di conservazione (cella frigo o atmosfera controllata, ULO) sulla manifestazione dei sintomi • l’influenza dei trattamenti effettuati sulla manifestazione dei sintomi • l’influenza del regime di coltivazione (biologico o integrato) sulla manifestazione dei sintomi

12. 2. Diffusione della malattia Individuazione aziende e tesi sperimentali Regime Trattamenti Conservazione tesi trattata fino a termine consentito Cella frigo Atmosfera controllata Azienda 1 Integrato Cella frigo tesi non trattata a partire da ingrossamento frutti Atmosfera controllata Azienda 2 tesi trattata in regime convenzionale da inizio ingrossamento frutti Cella frigo Atmosfera controllata Biologico Cella frigo tesinon trattata fino alla raccolta Atmosfera controllata Valutate e catalogate 2101 mele

13. 2. Diffusione della malattia Kruskal-Wallis Test (Nonparametric ANOVA) GraphPadInStatversion 3.00 L’ incidenza della malattia non è risultata correlata con la tipologia di conservazione

14. 2. Diffusione della malattia Kruskal-Wallis Test (Nonparametric ANOVA) GraphPadInStatversion 3.00 L’ incidenza della malattia è risultata maggiore: • nelle tesi non trattate rispetto a quelle trattate • nelle tesi biologiche rispetto a quelle integrate

15. 2. Diffusione della malattia • Conclusioni: • L’incidenza della malattia non è risultata correlata alla tipologia di conservazione (cella frigo o ULO) • L’incidenza della malattia è risultata inferiore nelle tesi trattate, rispetto a quelle in cui i trattamenti sono stati sospesi in primavera o che non sono state sottoposte a trattamenti • L’incidenza della malattia è risultata superiore nelle tesi biologiche, rispetto a quelle sottoposte a regime integrato

16. 3. Eziologia IDENTIFICAZIONE DEL MICRORGANISMO AL MICROSCOPIO OTTICO IDENTIFICAZIONE SINTOMI DELLA MALATTIA IN CAMPO Applicazione dei POSTULATI DI KOCH Osservazione dei sintomi tipici e REISOLAMENTO DA MELEINOCULATE ARTIFICIALMENTE ISOLAMENTO e identificazione dell’ AGENTE PATOGENO INOCULO PATOGENO SU MELE SANE IN LABORATORIO

17. 3. Eziologia Isolamento da mele sintomatiche da campo e da cella frigo, su diversi substrati (Potato Dextrose Agar, Potato Carrot Agar, Agar buccia di mela)e diverse metodiche(da porzione di buccia infetta, da raschiatura, da acqua di lavaggio di buccia infetta; incubazione a T° ambiente o T° controllata a 25°C)per isolare tutta la flora microbica presente Sviluppo di ununico microrganismo ricorrente

18. 3. Eziologia Dictiospore di Alternariaal microscopio ottico Identificazione dell’agente causale al microscopio ottico, confermata da riconoscimento presso Istituto di Micologia Olandese (CBS): gruppo Alternaria alternata

19. 3. Eziologia Verifica dei postulati di Koch: Inoculo artificiale in laboratoriosu mela sana (immersione intere mele in soluzione di spore di Alternaria2*105 spore/ml, conservazione in cella frigo o a T° ambiente fino a comparsa dei sintomi) Reisolamento su piastra da sintomatologia indotta

20. 3. Eziologia Conclusioni: • l’agente causaledella malattia è risultato appartenere al genere Alternariaspp. • l’applicazione dei Postulati di Koch ha confermato un solo microrganismo fungino quale agente della malattia, sia in campo che nelle celle di conservazione

21. 4. Strategia di controllo chimico:agricoltura convenzionale Capacità inibitoria dei principali fungicidi usati in melicoltura: • Cyprodinil (Chorus) • Difenconazolo(Score) • Fluazinam(Ohayo) • Zolfo puro (Thiopron) • Pyraclostrobin(Bellis) • Boscalid(Cantus) • Dodina(Syllit) • Penconazolo(Topas) • Pyrimethanil (Scala) • Metiram(Polyram) • Iprodione(Rovral) • Captano (Make-up) 2 prove parallele: Inibizione della crescita del micelio di Alternaria Inibizione della capacità germinativa delle spore di Alternaria

22. 4. Strategia di controllo chimico:agricoltura convenzionale Inibizione della crescita del micelio di Alternaria: 4 principi attivi sono risultati efficaci: - Difenconazolo(Score) - Iprodione(Rovral) - Penconazolo(Topas) - Cyprodinil(Chorus)

23. 4. Strategia di controllo chimico:agricoltura convenzionale Inibizione della capacità germinativa delle spore di Alternaria

24. 4. Strategia di controllo chimico:agricoltura convenzionale

25. Penconazolo(Topas) 2% di spore di Alternaria germinate Principio attivo Inoculo patogeno Inoculo patogeno Testimone Testimone

26. Cyprodinil(Chorus) 15% di spore di Alternaria germinate Principio attivo Inoculo patogeno Inoculo patogeno Testimone Testimone

27. 4. Strategia di controllo chimico:agricoltura biologica Rame ossicloruro Colonia a 4 giorni di crescita su PCA 17 volte la dose consigliata in etichetta (60 gr/lt) 12 volte la dose consigliata in etichetta (40 gr/lt) 23 volte la dose consigliata in etichetta (80 gr/lt) 29 volte la dose consigliata in etichetta (100 gr/lt)

28. 4. Strategia di controllo chimico:agricoltura convenzionale e biologica Conclusioni: • Sono stati individuati alcuni principi attivi in grado di controllare la crescita del micelio e la germinazione delle spore di Alternariaspp., in particolare il Penconazolo e il Cyprodinil sono risultati i più efficaci • Il rame ossicloruro, utilizzato nei regimi di agricoltura biologica, non dotato di selettività ed efficace nei confronti di gran parte degli organismi microfungini, non si è dimostrato efficace nei confronti di Alternariaspp.

29. Progetto AgerStayFresh 1.2.4. Ricercadiantagonistinaturalicontromalattiedi post-raccoltasumela Inizio progetto: 2011 Il progetto di ricerca AGER STAYFRESH “Strategie innovative rispondenti ai bisogni delle imprese nel comparto degli ortofrutticoli della IV gamma”, si è occupato anche della ricerca di trattamenti fitoiatrici sostenibili, basati sull’utilizzo di antagonisti naturali contro i patogeni vegetali. Attività previste (Task/activities): 1.2.5. Applicazionediantagonistinaturali e monitoraggiosumela (+) Caratterizzazionedell’agentecausaledellamalattia

30. Caratterizzazione dell’agente causale Valutazione della possibile variabilità genetica (caratterizzazione molecolare) del patogeno, a causa della difficoltà del riconoscimento morfologico delle specie di Alternaria «small-spored» (Polizzotto et al., 2012): Analisi molecolari su 41 ceppi di Alternariaspp. isolati da mele sintomatiche: • Estrazione del DNA da micelio fungino • Amplificazione della regione ITS (InternalTranscribedSpacer) con tecniche di PCR-RFLP • Confronto con i profili di restrizione dei ceppi di riferimento di A. alternata, A. arborescense A. tenuissima A. arborescens A. alternata

31. Caratterizzazione dell’agente causale • Analisi molecolari su 41 ceppi di Alternariaspp. isolati da mele sintomatiche: • Amplificazione della regione IGS(IntergenicSpacer) con tecniche PCR-RFLP • Confronto con i profili di restrizione dei ceppi di riferimento di A. alternata, A. arborescense A. tenuissima A. arborescens A. arborescens A. alternata A. alternata

32. Caratterizzazione dell’agente causale Caratterizzazione morfologica su 41 ceppi di Alternariaspp. isolati da mele sintomatiche: • osservazione delle colonie su terreni Potato Carrot Agar e DRYES A. arborescens A. alternata Tot: 17 ceppi A. arborescens, 24 ceppi A. alternata

33. Caratterizzazione dell’agente causale • Ripetizione prova di patogenicità: • inoculo patogeno su mela sana • melesterilizzate in superficie con esposizione a raggi UV-C (UNIUD-DIAL, 10’ per lato, λ 254 nm) • individuati 6 spot per ciascuna mela, in 3 diverse posizioni (calice, peduncolo, equatore) e inoculati con una soluzione di spore (2*105 spore/ml)di Alternariaarborescens(3 ceppi diversi) e Alternaria alternata(3 ceppi diversi) • valutazione dello sviluppo dei sintomi tipici della malattia (fumaggine nerastra) a T ambiente e a 0°C

34. Caratterizzazione dell’agente causale • Spot sintomatici alla fine della prova(30 dpi a T°amb, 80 dpi a 0°C) Percentuale di spot con sintomi Spot sintomatico, a occhio nudo e allo stereomicroscopio

35. Caratterizzazione dell’agente causale Conclusioni: • Sono stati isolati diversi ceppi fungini associati alla sintomatologia descritta e appartenenti al gruppo di Alternaria alternata • In particolare, sono stati identificati 24ceppi di A. alternatae 17 ceppi di A. arborescens • Le prove di patogenicità effettuate hanno permesso di stabilire che A. arborescensè in grado di provocare sintomi identici a quelli osservati in campo • A. alternata invece ha manifestato una minor virulenza, con sintomi più lievi e assenza del caratteristico odore organico • La valutazione dei sintomi ad occhio nudo è risultata spesso difficoltosa (necessità di uso dello stereomicroscopio)

36. Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti Ricerca degli antagonisti: 90 isolamenti da mele asintomatiche in cella frigo

37. Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti • 73 isolati tra lieviti e funghi utilizzati per prove di antagonismopreliminari in vitro controAlternariaspp. Alternaria ORGANISMI EFFICACI antagonista ORGANISMI NON EFFICACI

38. Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti 57 microrganismi sono risultati in grado di ostacolare la crescita del patogeno

39. Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti Identificazione degli antagonisti: • Suddivisione morfologica • Estrazione rapida del DNA genomico fungino • PCR-RFLP • Sequenziamento e confronto in GenBank

40. Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti Identificazione degli antagonisti: N°dicolonie ottenute dagli isolamenti

41. Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti Azione degli antagonisti: Prove di antagonismo in vitro a T° ambiente per : AureobasidiumCryptosporiopsisAcremonium Alternaria(controllo)

42. Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti Crescita della colonia di Alternaria(in mm) in presenza degli antagonisti (temperatura ambiente) Diametro della colonia in mm

43. Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti Azione degli antagonisti: Prove di antagonismo in vitro in cella frigorifera (≈ 0°C) per : AureobasidiumCryptosporiopsisAcremonium Alternaria(controllo)

44. Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti Crescita della colonia di Alternaria(in mm)in presenza degli antagonisti (0°C) Diametro della colonia in mm

45. Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti Analisi molecolari su 27 ceppi isolati di Aureobasidiumspp.: • Analisi della porzione ITS nessuna differenza evidenziabile • Analisi con tecniche di rep-PCR • suddivisione in circa 10 gruppi molecolari Le sequenze ottenute dalla porzione ITS di 2 ceppi rappresentativi hanno mostrato una similarità di sequenza del 100% con la sequenza di A. pullulansvar. pullulansstrain CBS 584.75 (accessionnumber FJ150906) presenti in banca dati

46. Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti • Verifica dell’azione antagonistica in vitro di ciascun gruppo nei confronti di diversi ceppi di Alternariaspp. (3 A. arborescens + 3 A. alternata) B B B B A A A A Azione antagonista di A. pullulans(A)nei confronti di A. arborescens (B) Azione antagonista di A. pullulans(A)nei confronti di A. alternata (B) • A. pullulans è risultato svolgere una valida azione antagonista nei confronti di A. arborescens, mentre non è risultato molto efficace nei confronti diA. alternata • Scelta di 4 ceppi rappresentativi di A. pullulansda usare nelle prove di antagonismo in vivo su mele frigoconservate: 1-4-6-10

47. Ricerca di potenziali microrganismi antagonisti Conclusioni: • Sono stati isolati diversi organismi con azione antagonistica nei confronti di Alternariaspp. • Gli organismi rivelatisi maggiormente efficaci (appartenenti a 3 diversi generi) sono stati utilizzati per prove di antagonismoa temperatura ambiente e a circa 0°C (t delle celle di conservazione) e hanno mostrato di ostacolare in maniera significativa la crescita del patogeno in entrambe le condizioni di temperatura • Gli organismi isolati appartenevano principalmente (27 su 57) alla specie Aureobasidiumpullulans, appartenenti a 10 gruppi molecolari • L’azione antagonistica è risultata più efficace nei confronti di A. arborescensche nei confronti di A. alternata • 4 ceppi di A. pullulanspiù efficaci in vitro sono stati scelti per prove in vivo

48. Applicazione di potenziali microrganismi antagonisti in pre-harvest • Prova di antagonismo in vivo contro A. arborescens: • individuazione a Maggio di un meleto da condurre senza trattamenti fungicidi • preparazione di una soluzione di cellule di Aureobasidiumpullulansceppi 1-4-6-10 ad una concentrazione finale di 2* 108 CFU/ml • 10 piante trattate ciascuna con 500 ml della soluzione ottenuta, distribuita con atomizzatore sull’intera chioma • 4 trattamenti durante la stagione: 28.06.13; 27.08.13; 03.09.13; 16.09.13 • raccolta mele da 10 piante trattate (circa 1000 frutti) e da 10 non trattate (circa 800 frutti) (controllo negativo) il 26.09.13 • individuati 6 spot per ciascuna mela in 3 diverse posizioni con le stesse modalità utilizzate per la prova di patogenicità, inoculati con una soluzione di spore di Alternariaarborescens(2*105 spore/ml) • valutazione dello sviluppo dei sintomi tipici della malattia (fumaggine nerastra) in presenza o assenza dell’antagonista, su mele conservate in ambiente con bassa umidità relativa a T° ambiente e a 0°C

49. Applicazione di potenziali microrganismi antagonisti in post-harvest • Prova di antagonismo in vivo contro A. arborescens: • mele non trattateinoculateper immersione in una soluzione di cellule di Aureobasidiumpullulans(5*108cfu/ml) • individuati 6 spot per ciascuna mela, in 3 diverse posizioni e con le stesse modalità utilizzate per la prova di patogenicità, e inoculati con una soluzione di spore di Alternariaarborescens(2*105 spore/ml) • valutazione dello sviluppo dei sintomi tipici della malattia (fumaggine nerastra) in presenza o assenza dell’antagonista, su mele conservate in ambiente con elevata umidità relativa a T° ambiente e a 0°C

50. Applicazione di potenziali microrganismi antagonisti in pre- e post-harvest Prova di antagonismoin vivo contro A. arborescensa T° ambiente Percentuale di spot con sintomi Comparsa dei primi sintomi (15 dpi) Fine prova (40 dpi) Fisher’s exact test: P < 0.0001, estremamente significativo