Cinétique et stochiométrie

1. Cinétique et stochiométrie A. Garnier GCH-2103 A-2010

2. Cinétique et stochiométrie • Définition • Les termes de base • Les modes d’opération • Les relations de base • Détermination théorique • Détermination expérimentale • Taux initiaux • Cuvée • Chemostat • Stop flow

3. Croissance cellulaire - variables

4. Mode d’opération • Système fermé: cuvée (batch) • Aucune entrée ou sortie • Régime transitoire • dX/dt = rX, dS/dt = rS • À t = 0, X = X0, S = S0

5. Cuvée alimentée (Fed-batch) F(t), Sin • Alimentation seulement • Régime transitoire • À t = 0, V= V0, X= X0, S= S0 • F sera contrôlé de manière à maintenir S constant, S=S0=Sc • Si S est constant, m le sera aussi, m= mc V, X, S

6. Chemostat (continu, CSTR) F, Sin • Une entrée, une sortie • Mélange idéal: Xout = X, Sout = S, Pout = P • Après une période initiale d’adaptation, ce système atteindra un régime permanent: • V= cst, X= cst, S= cst, P= cst F, S, X, P V, X, S, P

7. Chemostat avec recirculation • Permet de concentrer les cellules dans le bioréacteur • Permet de repousser le lavage • Développement pour X seulement F F(1+w) F(1+w) Fc, Xc Fex, Xx V, X wF, Xx Bioréacteur Décanteur

8. Croissance cellulaire –type de modèles Structuré: Tient compte de métabolites intra-cellulaires Ségrégé: Tient compte d’une distribution de population

9. Modèles de croissance • Du plus simple au plus compliqué • Exponentiel (ordre 0!!) • Linéaire (logistique) • Monod • Autres • Phénomènes connexes • Maintenance • Mortalité • Production • Luedeking-Piret combiné aux différents modèles

10. Modèle enzymatique - Monod • Pour un système fermé (cuvée) en supposant YX/S constant: (1) (2) (3) • Une variable indépendante, 3 variables dépendantes, • trois équations = Une solution!

11. Modèle de Monod • Équation 3 n’est peut-être pas nécessaire: Xmax-X = Yx/s * S Alors:

12. Modèle de Monod

13. Modèle de Monod Sachant que:

14. Modèle de Monod S = (Xmax-X)/Yx/s

15. Détermination théorique • Cinétique… • Rendement: modèles structurés (stochiométriques et autres)

16. Lipides Acides gras glycerol lactate éthanol [C6H12O6]n C6H12O6 G3P pyruvate Acétyl-CoA purines Acides nucléiques pyrimidines Ac.aminés Cycle de Krebs NADH ADP O2 NAD+ ATP H2O protéines Chaîne respiratoire Une vue très simplifiée du métabolisme cellulaire Le catabolisme génère de l’ATP et du NADH Modèle stochiométrique (cliquez ici)

17. Autres valeurs du coefficient de rendement (Bailey&Ollis, McGraw-Hill, 1986)

18. Détermination expérimentale • Coefficient de rendement • Cinétique • Taux initiaux • Stop-flow • Cuvée • Chemostat

19. Détermination expérimentale du coefficient de rendement - YX/S constant S = (Xmax-X)/Yx/s

20. Estimation des rendements en cuvée Avec des données de t, X, S, on peut calculer, Yx/s par un graphe de X vs S: Ici, Yx/s = 0,5

21. Effet de maintenance • S = S(croissance) + S(maintenance) • rS = 1/YG* rX + m * X • qs = 1/YG* m + m • 1/Yx/s = qs/m = 1/YG + m/ m

22. Effet de maintenance • 1/Yx/s = qs/m = 1/YG + m/ m

23. Effet de mortalité • Le taux de mortalité cellulaire: rd = - kd*X où kd=cste • Donc en cuvée: dX/dt = m*X – kd*X = (m– kd)*X En général, on néglige la maintenance et la mortalité en cuvée

24. NH3 GLUCOSE PYRUVATE glutamate TCA cycle, OU lactate resp. chain GLUTAMATE pyruvate glucose NH3 GLUTAMINE -Ljunggren and Haggstrom, Biotechnol. Bioeng., 44: 808-818, 1994 (Hybridoma) Mécanisme de débordement: effet sur la cinétique et le rendement glutamine

25. Détermination de la cinétique – Taux initiaux Évaluation de qglc, qgln, qlact et qNH3

28. Systèmes d’analyse de cinétique rapide Méthode de flux arrêté (Stopped-flow): Un moteur va actionner 2 ou 3 seringues contenant les réactifs qui seront mélangés. Le mélange est ensuite aspiré dans la cuvette d’observation par la seringue « stop ».

29. Lumière Détection Systèmes d’analyse de cinétique rapide Moteur Réactif 1 Réactif 2 Temps mort : Temps pour lequel on ne peut avoir de données (temps de mélange) Mélangeur De l’ordre de 1 milliseconde. Moteur Moteur

30. Systèmes d’analyse de cinétique rapide Les composés seront analysés par des méthodes spectrophotométriques à l’aide de : • Photodiodes • Dichroïsme circulaire • Tube photomultiplicateur • Matrice CCD (2048 longueurs d’ondes analysées en 3,5 millisecondes)

31. Systèmes d’analyse de cinétique rapide Méthode de flux étanché (Quenched-flow) : Méthode utilisées lorsqu’on ne dispose pas de méthodes optiques satisfaisantes pour étudier l’apparition des produits et des intermédiaires. Il faut arrêter rapidement les réactions enzymatiques pour pouvoir collecter les mélanges et les analyser.

32. Systèmes d’analyse de cinétique rapide Méthode de flux étanché (Quenched-flow) : • Types d’étanchage : • Étanchage chimique : Ajout d’acide ou de base (ex. HCl 1M) • Étanchage physique : Congélation ultra-rapide.

33. Systèmes d’analyse de cinétique rapide Moteur Moteur Réactif 1 Réactif 2 Délai réactionnel de l’ordre de 2 à 100 millisecondes Mélangeur Agent étanchant Mélangeur Chambre réactionnelle linéaire Récupération des fractions

34. Systèmes d’analyse de cinétique rapide Les fractions recueillies sont analysées par des méthodes non-optiques : • Spectroscopie de masse « en ligne » • Chromatographie HPLC ou en phase gazeuse • Électrophorèse sur gel, • Comptage à scintillation, • etc…

35. Estimation des paramètres de Monod en cuvée • Puis on peut reformuler l’équation de X pour isoler des termes reliés linéairement: ÷t ÷t Y = b + m X

36. Monod – estimation des paramètres mmax = 1 m = 0,2475 = Ks*Yx/s/Xmax Ks= 0,2475*10,1/0,5 Ks= 5

37. Utilisation du Chemostat pour la détermination des paramètres cinétiques • Relation cinétique, par exemple Monod:

38. Prochain labo: Cuvée alimentée (Fed-batch) F(t), Sin • Alimentation seulement • Régime transitoire • À t = 0, V= V0, X= X0, S= S0 • F sera contrôlé de manière à maintenir S constant, S=S0=Sc • Si S est constant, m le sera aussi, m= mc V, X, S

39. Cuvée alimentée (Fed-batch) • 3 bilans seront nécessaires pour obtenir un modèle de ce système: F ….

40. Cuvée alimentée (Fed-batch)

41. Cuvée alimentée (Fed-batch) 0 F

42. Cuvée alimentée (Fed-batch)