1 / 32

Enzymová kinetika

Enzymová kinetika. Enzym ová kineti ka. studuj časový průběh enzymové reakce za různých reakčních podmínek zabývá se faktory, které ovlivňují r ychlost reakcí katalyzovaných enzymy Rychlost enzymové reakce závisí na: koncentrace substr á t ů koncentraci enzymu

ashanti
Download Presentation

Enzymová kinetika

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. Enzymová kinetika

  2. Enzymová kinetika • studuj časový průběh enzymové reakce za různých reakčních podmínek • zabývá se faktory, které ovlivňují rychlost reakcí katalyzovaných enzymy Rychlost enzymové reakce závisí na: • koncentrace substrátů • koncentraci enzymu • Fysikálně chemické vlastnosti prostředí (iontová síla, pH, teplota...) • Přítomnost aktivátorů a inhibitorů Proč studovat enzymovou kinetiku? • Charakterizace substrátové preference enzymů • Identifikace a studium inhibitorů

  3. Typy enzymových reakcí Jednosubstrátové reakce • Jeden substrát jeden produkt (isomerasy) • Jeden substrát dva produkty (lyasy) • Jeden substrát a voda dva produkty (hydrolasy) Dvousubstrátové reakce • Dva substráty dva produkty (oxidoreduktasy, transferasy) • Dva substráty jeden produkt (lyasy) Třísubstrátové reakce • Dva substráty a ATP  jeden hlavní produkt a dva produkty z ATP (ligasy)

  4. Závislost reakce na koncentraci substrátu a enzymu • V roce 1902 Brown studoval rychlost hydrolytického štěpení sacharosy na fruktosu enzymem b-fruktofuranosidasou: • sacharosa + H2O glukosa + fruktosa • Při konstantní koncentraci sacharosy (a různé koncentraci enzymu) byla závislost počáteční rychlosti reakce na koncentraci enzymu lineární

  5. Závislost reakce na koncentraci substrátu a enzymu • Pokud je koncentrace enzymu konstatní, a mění se koncentrace substrátu, je závislost počáteční rychlosti na koncentraci substrátu hyperbolická

  6. Enzymová kinetika Leonor Michaelis Maud Menten

  7. Enzymová kinetika – matematické odvození Cíl: vypracování rovnice vyjadřující rychlost katalyzované reakce Jako příklad uvažujme jednoduchou nekatalyzovanou reakci: S ===> P Rychlost reakce je charakterizována rychlostí přírůstku produktu P Reakční rychlost je přímo úměrná koncentraci substrátu [S]

  8. Rovnice Michaelise a Mentenové k1 kcat E + S <===> ES ===> P + E k-1 Základním předpokladem je existence komplexu enzym-substrát (ES) K1je rychlostníkonstantapro tvorbu ES (rychlost = k1[E][S]) K-1jerychlostní konstantapro disociaci ES (rychlost = k-1[ES]) Celková rychlost reakceje:

  9. Nemůžeme ale snadno měřit [ES]. Cílem je stanovit [ES] jako funkci parameterů které můžeme měřit. • Michaelis a Mentenová použili dva základní předpoklady: Rovnice Michaelise a Mentenové • 1. Předpokládáme, že k1 ak-1jsou podstatně větší než kcat, takže enzym a substrát jsou v rovnováze. • V rovnováze je rychlosttvorby komplexu [ES] stejná jako rychlost jeho disociace, takže: • k1[E][S] = k-1[ES] • Po úpravě: • kde KSje definovánajakorovnovážná disociační konstanta.

  10. Rovnice Michaelise a Mentenové 2.Předpokládáme žepočáteční koncentrace substrátu [S]o, je mnohem větší než celková koncentrace enzymu [E]tot, takže během prvé periody enzymové reakce (než je spotřebována podstatná část substrátu), je koncentrace volného substrátu stejná jako původní celková koncentrace substrátu (která je při expertimentu známa): tj.. [S]o >> [E]tottakže [S] ≈ [S]o Omezíme pozorování a výpočty pouze na počáteční rychlost reakce.

  11. E + S <===> ES ===> P + E Rovnice Michaelise a Mentenové Enzym není v průběhu reakce spotřebováván, takže: [E]tot = [E] + [ES] Náhrada za [E] (zavedení KS): Přeskupení: Tedy:

  12. Rovnice Michaelise a Mentenové Totoje rovnice hyperboly. Pro [S] v kcat[E]totkterou definujeme jakovmax. Máme tedy: kde vmax = kcat[E]tot (Připomenutí: [S] ≈ [S]o a vje počáteční rychlost reakce.) zero order 1st order [S] = Low → High

  13. v or [ES] Steady state Time Nemůžeme předpokládat, že k1 a k-1jsou vždy větší než kcat Místo předpokladu rovnováhy mezi E, S a ES, uvažujeme tvorbu ustáleného stavu. Předpokládáme, že (pro [S]o >> [E]tot) reakce rychle dosáhne stav během kterého je koncentrace [ES] konstantní. Enzymová kinetika podle Briggse a Haldanea Předpokládáme tedy: Reakční schéma je: k1 kcat E + S <===> ES ===> P + E k-1 reakční rychlost v = kcat[ES]

  14. Konstantní koncentrace ES v ustáleném stavu Concentration Reaction Time S P ES E

  15. v or [ES] Steady state Time k1 kcat E + S <===> ES ===> P + E k-1 Enzymová kinetika podle Briggse a Haldanea k1 [E][S] = k-1[ES] + kcat [ES] Úprava: Tedy: kde KMje známa (nepřesně!!) jako Michaelisova konstanta. Pokud k-1 >> kcat, KM KS (= k-1/k1).

  16. Pro výpočet reakční rychlosti použijeme stejný postup: Enzym není spotřebován: [E]tot = [E] + [ES] Náhrada za [E] (z výrazu proKM): Úprava: Tedy: kdevmax = kcat[E]tot. Enzymová kinetika podle Briggse a Haldanea

  17. Vmax[S] vo = Km+[S] Enzymová kinetika podle Briggse a Haldanea Tyto dva postupy vedou k podobným rovnicím: Michaelis-Menten Briggs-Haldane

  18. Double-reciprocal Lineweaver-Burke Plot 1/v KM/vmax 1/vmax 1/[S] -1/KM B-H poskytuje obecnějšírovnici pro rychlost enzymových reakcí. Pro usnadnění výpočtů je často používána v reciproké formě. Převrácením obou stran rovnice dostaneme: Graf 1/vproti 1/[S] poskytuje přímku se směrnicí KM/vmaxa úsekem na ose y o hodnotě 1/vmax Enzymová kinetika podle Briggse a Haldanea

  19. Km: Afinitavůči substrátu Vmax[S] vo = Km+[S] Vmax Ifvo = 2 Vmax Vmax[S] = 2 Km+[S] Km+[S] = 2[S] Km= [S] Km When using different substrate Vmax S2 S1 S3 1/2 S1S2S3 Affinity changes

  20. Důležitost KM • Nezávisí na koncentraci enzymu • Závisí na reakčních podmínkách • Hlavní substrát má nejnižší KM • Koncentrace substrátu pro dosažení limitní rychlosti je cca 100 KM

  21. KM

  22. Km: příklad hexokinasy CHO H-C-OH HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH CHO H-C-OH H-C-OH H-C-OH H-C-OH H2-C-OH CHO HO-C-H HO-C-H H-C-OH H-C-OH H2-C-OH Glucose + ATP → Glc-6-P + ADP Substrát Glukosa Allosa Manosa číslo 1 2 3 4 5 6 Km = 8 8,000 5 mM

  23. Číslo přeměny, molární aktivita enzymu, kcat k1 kcat E + S ES E + P (vo) k2 kcat, číslo přeměny (turn over number, t.o.n) Počet molekul substrátu přeměněných jednou molekulou enzymu za jednu sekundu

  24. Číslo přeměny vybranýchenzymů Enzymy Substrát kcat(s-1) KatalasaH2O2 40,000,000 Karbonát-hydrolyasaHCO3- 400,000 AcetylcholinesterasaAcetylcholin 140,000 2,000 b-LaktamasaBenzylpenicilin FumarasaFumarát 800 Počet molekul produktu získanéhoze substrátu jednou molekulou enzymuza sekundu Adapted from Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.263

  25. Jak stanovit KM aV 1 vo vo 1 Vmax - 1 Km 1/S S 1)použij známé množstvíenzymu→E 2)přidej substrátv různých koncentracích→S(osa x) 3)změř produkt v určeném čase (P/t) →vo(osa y) 4)(x, y) graf, hyperbolickákřivka, limita →Vmax 5)pokud y = 1/2 Vmaxspočti x ([S]) →Km Vmax 1/2 Km Double reciprocal Direct plot

  26. Jednotky enzymovéaktivity Specifická aktivita y x = = tan S →Pmmol t Produkt [P] vo = [P]/min směrnice tan mmol /min Unit = 0 10 20 30 40 Reakčnídoba(min) Jednotky aktivity y Protein (mg) x

  27. kcat/Km (katalytická účinnost) chymotrypsinu O RO H3C–C–N–C–C–O–CH3 HH = = – Norvalin –CH2–CH2–CH3 3.6 ╳ 102 – – Norleucin –CH2–CH2–CH2–CH3 3.0 ╳ 103 –CH2– Phenylalanin 1.0 ╳ 105 kcat / Km R = Glycin –H 1.3 ╳ 10-1 (M-1 s-1) Adapted from Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.379

  28. Vmax[S] vo = Km+[S] • přídavek enzymu (zvýšení [E]tot) • přídavek substrátu (zvýšení [S]) • modifikace enzymu(optimalizace kcatnebo KS) Jak zvýšit rychlost reakce

  29. Kinetika vícesubstrátových reakcí • Nejčastěji přeměna dvou substrátů na dva produkty • Reakce může probíhat různými mechanismy

  30. Mechanismus následný (postupný, sekvenční) uspořádaný • Vazba prvého substrátu A změna konformace komplexu (indukované přizpůsobení) vazba druhého susbtrátu B (volný enzym má pro něj malou afinitu) vznik komplexu EAB • Přeměna komplexu EAB na EPQ (enzym s reakčními produkty) • Postupné oddělení jednoho a poté druhého produktu • Využíván např. u oxidoreduktas (substrát A je NAD+)

  31. Mechanismus následný (postupný, sekvenční) náhodný • Pokud nezáleží na sledu vazby substrátů na enzym a na pořadí uvolňování produktů • Enzym má zhruba stejnou afinitu k oběma substrátům

  32. Mechanismus ping-pongový • Na enzym se naváže prvý substrát, dojde k reakci, oddělí se prvý produkt • Substrát předá nějakou skupinu  enzym se uvolní v pozměněné formě • Poté připojení druhého substrátu, který převezme od enzymu skupinu z prového substrátu • Poté uvolnění produktu a obnova enzymu • Transferasy

More Related