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V8 Protein-Liganden-Wechselwirkung – anschaulich betrachtet

V8 Protein-Liganden-Wechselwirkung – anschaulich betrachtet. Beispiele für Protein-Liganden Komplexe Wo ist das aktive Zentrum? (Docking wird hier nicht behandelt – siehe Spezialvorlesungen von A. Kämper und A. Hildebrandt/D. Neumann im SS05) Wie stark binden Liganden an Proteine?

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V8 Protein-Liganden-Wechselwirkung – anschaulich betrachtet

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Presentation Transcript

  1. V8 Protein-Liganden-Wechselwirkung –anschaulich betrachtet Beispiele für Protein-Liganden Komplexe Wo ist das aktive Zentrum? (Docking wird hier nicht behandelt – siehe Spezialvorlesungen von A. Kämper und A. Hildebrandt/D. Neumann im SS05) Wie stark binden Liganden an Proteine? Wie kann man die Affinität des Liganden verbessern?

  2. beta-Trypsin:Benzamidin (3ptb) Enge, sehr polare Bindungstasche auf Proteinoberfläche. Amidin-Gruppen des Liganden bilden 4 H-Bindungen mit Carboxylgruppen des Proteins (Trypsin) aus. Benzolring passt optimal in hydro-phobe Tasche. www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock

  3. Cytochrome P450cam : Kampher (2cpp) Weites, recht unpolares aktives Zentrum im Proteininneren. Hämgruppe katalysiert Reaktion. Partielle Desolvatation. Wie gelangt Substrat hinein? www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock

  4. Maus-Antikörper McPC-603:Phosphocholine (2mcp) Bindungstasche auf Proteinoberfläche wird durch drei hypervariable Loops geformt. www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock

  5. Streptavidin:Biotin (1stp) Sehr polare, tiefe Bindungstasche. Außerordentlich starke Affinität. www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock

  6. HIV-1 Protease:XK-263 Inhibitor (1hvr) Inhibitor XK-263 stammt von Merck-Dupont. Er enthält eine 7-Ring zyklische Urea-Einheit mit Phenyl- und Naphtyl-Ringen. Die CO-Gruppe ahmt das ansonsten konservierte Wassermolekül 301 nach und verdrängt es. Der tiefere Teil des zyklischen Urea-Rings enthält zwei benachbarte Hydroxylgruppen, die H-Bindungen mit den katalytischen Aspartat-Residuen bilden. www.scripps.edu/pub/olson-web/doc/autodock

  7. Identifikation von funktionellen Residuen 1 Funktionelle bzw. katalytische Residuen werden traditionell in (hoch) konservierten Regionen von Multiple Sequence Alignments erwartet evtl. Kopplung mit Information über 3D-Struktur 2: finde Residuen, die Proteinstruktur destabilisieren. Grund: Funktionelle Residuen im Proteininneren sind oft energetisch ungünstig. Funktionalität auf Kosten von Stabilität. 3: finde Löcher oder Einbuchtungen in Proteinstruktur. Hier vorgestellt: integrierte Methode, die 1 -3 implementiert. Möglichkeit für funktionelle Annotation von Proteinen mit unbekannter Funktion.

  8. Wo ist das aktive Zentrum I? Auswahl von 49 Enzymen. Kriterien: - Auflösung  2.0 Å - funktionelle Residuen sind bekannt (in Swissprot-Eintrag in ACT_SITE) - enthalten nur eine Domäne (SCOP Datenbank) - die SCOP-Einträge sind unterschiedlich - es gibt  10 homologe Sequenzen mit Blast E-Wert < 10-10. 98 katalytische Residuen: 22 His 17 Asp, Glu 10 Cys 8 Ser 7 Arg, Lys Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003) 5 Tyr 3 Asn 2 Thr

  9. Repräsentative Enzyme PDB Protein Länge Auflösung EC Zahl Zahl und Namen der SCOP Seq. katalytischen Residuen

  10. Repräsentative Enzyme

  11. Fitness-Funktion - Bewertung der Seitenketten-Konformation entsprechend Rotamer-Bibliothek - Seitenketten-Packung (wissensbasiert) - Hydratation (wissensbasiert) • Analyse der Proteinoberfläche (MSP-Programm): Zuordnung zu den einzelnen Residuen - elektrostatische Energie: AMBER-Partialladungen  elektrostatisches Potential (aus Poisson-Boltzmann-Rechnung) Jeder Score(S), Rang (R) und Position (L) werden gegen den Mittelwert und die Standardabweichung für jeden Aminosäuretyp normalisiert. Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003)

  12. Vorhersage katalytischer Residuen in Enzymen Beispiel: 3D-Profil für Lysozym aus Hühnereiweiss. D52 ist katal. Residue. native Hydratations- lokale D52 hat sehr schlechten Rang. D.h. Residue klasse Struktur es wäre günstig D52 zu ersetzen. Katalytische Residuen sind stets un- stabiler als nicht-katalytische. Score Rang Score native native beste Residue Residue Residue Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003)

  13. Vorhersage katalytischer Residuen in Enzymen Flussdiagramm der Vorhersagemethode. - Links oben Analyse der Konservierung. - Rechts oben Analyse der Position in 3D-Struktur bzw. Stabilität der Mutantenproteine - untere Hälfte trifft für verschiedene Aminosäuretypen (1-Letter-code) die Entscheidung, ob katalytische Residuen vorliegen. Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003)

  14. Vorhersage katalytischer Residuen in Enzymen Proteinstrukturen mit unbekannter Funktion. Die vorgeschlagenen katalytischen Residuen sind markiert. Ota, Kinoshita, Nishikawa, J Mol Biol 327, 1053 (2003)

  15. Wo ist das aktive Zentrum II Analyse mit elektrostatischen Kontinuumsrechnungen Die Titrationszustände der meisten Aminosäuren folgen der Henderson-Hasselbalch-Gleichung. Berechne Titrationskurven für 3 Enzyme mit UHBD. TIM und AR haben eine sehr ähnliche Strukturen, katalysieren aber ganz unterschiedliche Reaktionen. AR und PMI haben sehr verschiedene Strukturen, katalysieren aber ähnliche Reaktionen. Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, 12473 (2001)

  16. Theoretische Titrationskurven Titrationskurven aller His-Residuen in TIM Triosephosphat Isomerase (TIM) katalysiert die Isomerierung von D-Glyceraldehyd- 3-Phosphat zu Dihydroxyaceton-Phosphat. Man findet 4 Residuen mit verschobenen, flachen Titrationskurven: His95, Glu165, Lys112, Tyr164. Davon liegen H95, E165 und Y164 eng beieinander. Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, 12473 (2001)

  17. Theoretische Titrationskurven Titrationskurven aller Tyr-Residuen in AR Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, 12473 (2001) Aldose-Reduktase (AR) katalysiert die Reduktion einer Aldehydgruppe von Aldose zu einem Alkohol. Man findet 7 Residuen mit verschobenen, flachen Titrationskurven: Tyr48, Cys298, Glu185, Lys21, Lys77, Tyr107, Tyr209. Tyr48, His110 und Cys298 bilden das aktive Zentrum. Die anderen Residuen liegen in der Nähe.

  18. Theoretische Titrationskurven Titrationskurven aller Lys-Residuen in PMI Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, 12473 (2001) PMI katalysiert die Interkonversion von Mannose-6-Phosphat und Fructose-6- Phosphat. Man findet 4 Residuen mit verschobenen, flachen Titrationskurven: His135, Lys100, Lys136, Tyr287. Alle liegen eng beieinander, die ersten 3 wohl im aktiven Zentrum und His135 nahe bei Lys136.

  19. Weitere Beispiele PDB ID Name Chemie Residuen mit auffälligen Titrationskurven 1AMQ Aspartat [H189, Y225, K258, R266, C191, C192], aminotransferase* Transamination [Y256], [Y295], [H301] 1CSE Subtilisin Peptidhydrolyse [D32, H64] Carlsberg (Serin-Protease) 1EA5 Acetylcholinesterase Ester Hydrolyse [Y130, E199, E327, H440, D392], [Y148], [H398], [H425] 1HKA 6-Hydroxymethyl-* Kinase [D97, H115] 7,8-dihydropterin pyrophosphate kinase 1OPY 3-Keto-5-Steroid Isomerase [Y16, Y32, Y57], [C81] isomerase 1PIP Papain Peptidhydrolyse [C25, H159], (Cys Protease) [K17, K174, Y186], [R59], [R96] 1PSO Pepsin Peptidhydrolyse [D32, D215, D303], [D11] (Säure-Protease) 1WBA Winged bean Speicherung - keine keine albumin Enzymfunktion Residue im zweiter Schale. Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, 12473 (2001) Residue im aktiven Zentrum

  20. Fazit Mittels elektrostatischer Kontinuumsrechnungen für bekannte Kristallstrukturen von Proteinen wurde für verschiedene externe pH-Werte die energetisch optimale Gesamtladung der Proteine berechnet. Aktive Zentren von Enzymen enthalten oft mehrere polare bzw. geladene Seitenketten um die chemische Umwandlung zu katalysieren. Deren Titrationszustände sind eng aneinander gekoppelt und zeigen im Vergleich zu isolierten Seitenketten sehr ungewöhnliche Titrationskurven. Diese Methode erlaubt also die Position von aktiven Zentren allein aufgrund der Proteinstruktur zu erkennen. Ondrechen, Clifton, Ringe, PNAS 98, 12473 (2001)

  21. Wie stark binden Liganden an Proteine? Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)

  22. exp. Affinitäten von Protein:Liganden Komplexen # Atome Ligand Target Typ    -log K1 1 Ca2+ Amino-transferase IM 6.70 IM: Metallionischer Inhibitor 1 Hg2+ Uroporphy-synthase IM 6.00 1 Mn2+ Inositol-phosphatase IM 5.70 1 Fe3+ Hydroxylase IM 5.30 1 Ag+ Arylformamidase IM 5.00 1 F-   Phosphotransferase IA 4.55 IA: kleiner anionischer Inhibitor 1 S2-   Peroxidase IA 4.28 1 Xe Myoglobin L 2.30 L: Ligand (Agonist oder Antagonist) 1 NH3 Meamine glutamate transferase I 1.79 I: Inhibitor 2 CO Myoglobin L 7.52 2 O2 Myoglobin L 6.18 2 Cyanide Methane oxygenase IA 6.00 2 Hydroxylamine Glycerol oxidase IC 5.92 IC: potentiell kovalente Wechselwirkung 3 Azide Glycerol oxidase IA 5.70 3 Ethylamine Protease I I 3.00 4 Thioacetamide Methan monooxygenase I 5.00 4 NO3-   Carbonate deydratase IA 4.70 4 Vanadate Phytase IA 4.55 5 Thiosemicarbazide Methane monoo xygen. I 6.00 5 SO42-   Creatine kinase IA 5.22 5 Iodoacetamide Methyl transferase IC 5.00 6 Putrescine Spermine synthase I 8.77 6 Aminooxyacetic acid Aminotransferase I 7.19 6 Oxalat Lactate dehydrogenase IA 5.80 7     -Aminobutyid acid Neuromanidase transmitter L 8.00 7 L-Cysteine Serine acetyl transferase I 6.22 7 Aminomethiozolidine Methyl transferase I 5.40 8 Muscimol     -aminobutylicacid agonist L 8.73 8 Bromopyrimidone Cytosine deaminase I 6.24 8 Phosphonoacetic acid DNA polymerase I 6.00 9 Acetopyruvate Acetoacetate decarboxylase I 7.00 9 Methyl iodotyrosine Tyrosine monooxygenase I 6.30 9 Nitrooxazolidinone Aldehyde dehydrogenase I 5.46 9 Benzamidine Trypsin I 4.77

  23. experimentelle Protein-Liganden Affinitäten # Atome Ligand Target Typ    -log K1 10 Allopurinol Xanthine oxidase I 9.17 10 Acetylcholine Cholinergic receptor L 8.14 10 Cabachol Cholinergic receptor L 7.85 11 Mercapto oxoglutaric Isocitrate dehydrogenase I 8.30 11 Diethyl pyrocarbonate Ca2+ transmitter L 8.80 11 Dopamine    ,   , -androgen receptor L 8.65 12 Norepinephrine Adrenergic agonist L 8.88 12 Nicotine Nicotinic receptor L 8.22 12 Hydroxybenzyl-Me3NR4 Acetycholiesterase I I 7.68 13 Tiamenidine     -Adrenergic agonist L 8.66 13 Serotonin 5-Hydroxy tryptamine receptor L 8.30 13 Benzyl mercaptopropionate Carboxypeptidase I 7.96 14 Guanabenz     -Adrenergic receptor L 9.02 14 Methylenpenicillanic     -Lactamase I 8.85 14 Captopril Carboxypeptidase I 8.70 15 Aminoclonidine L 9.32 15 Guanfacine     -Adrenergic agonist L 8.73 15 Isatin derivative Rhino protease I 7.30 16 Acetophenone derivative ACEsterase IC 14.89 16 Biotin Streptavidin L 13.43 16 Naphazoline Adrenergic L 8.73 17 Melatonin Melatonin receptor L 8.96 17 Guanine derivative Purine nucleoside phosphorylase I 7.96 17 piperoxan antihyper. receptor L 7.85 18 Iodomelatonin Melanin receptor L 10.68 18 Alprenolol     -adrenergic receptor L 9.47 18 Phosphoramidon Metalloproteinase I 7.55 19 Vesamicol Vesamicol receptor L 9.47 19 Propranolol     -adrenergic receptor L 9.39 19 Trimethopri der Dihydrofolate reductase I 8.53 20 Estradiol Steroid receptor L 9.69 20 Melatonin derivative Melatonin receptor L 9.68 20 Vesamicol derivative Vesamicol receptor L 9.20 21 2-Carboxyl arabinitol bisphosphate Ribulose carboxylase I 12.72 21 4-Carboxyl arabinitol bisphosphate Ribulose carboxylase I 10.55 21 Triprolidine Histamine antagonist L 9.98 21 Trimethoprim dihydrofolate reductase I 8.44 Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)

  24. experimentelle Protein-Liganden Affinitäten # Atome Ligand Target Typ    -log K1 22 Amitriptylinoxide Antidepressant L 9.02 22 Mazindol derivative Dopamine transporter L 8.82 22 Indolyl ethyl amines 5-Hydroxy tryptamine receptor L 8.49 22 Isatin derivative Rhino protease I 8.00 23 Vesamicol der. VR L 11.05 23 Neuraminic acid der. Sialidase I 10.52 23 Melatonin der. melamin receptor L 10.24 23 Vesamicol der. VR L 10.17 24 Vesamicol der. VR L 11.19 24 Isatin der. Rhino protease I 8.70 24 Methadone Narcotic L 8.66 25 Melatonin der. Melamin receptor L 9.62 25 Corticosterone Steroid receptor L 8.51 25 Isatin der. Rhino protease I 8.40 26 Aldosterone Steroid receptor L 9.32 26 Haloperidol Antipsychotic L 9.02 26 Yohimbine     -2 adrenergic receptor L 8.73 26 Isatin der. Rhino protease I 8.40 27 Vesamicol der. VR L 9.74 27 Dexetimide Anticholinergic L 8.80 27 Dehydrosinefungin mRNA Me trans. I 8.74 28 Vesamicol der. VR L 9.82 28 Indoyl ethyl amines 5-Hydroxy tryptamine receptor L 9.70 28 Prazosin     1-adrenergic agonist L 9.62 29 Spiperone L 10.27 29 Ketanserin Serotonin antagonist L 9.39 29 Dextromoramide Analgesic L 9.02 30 Peptide phosphonates Carboxy peptidase IM 12.00 30 Domperidone Dopamine antagonist L 10.13 30 Etorphine Narcotic L 9.91 Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)

  25. experimentelle Protein-Liganden Affinitäten # Atome Ligand Target Typ    -log K1 31 Carboxamide derivative 5-Hydroxy tryptamine receptor L 9.54 31 Benzodiazepine derivative Integrin antagonist L 8.60 31 Budesonide Glucocorticoid receptor L 8.54 31 Flavin mononucleotide Cytochrome b reductase I 8.10 32 Serotonin dimer 5-Hydroxy tryptamine receptor L 9.34 32 Cyclic urea HIV protease I 8.85 32 Hoechst 33258 DNA L 7.41 33 Methotrexate Dihydrofolate reductase I 9.70 34 Cyclic-aza isostere HIV protease I 10.21 34 Buprenorphine narcotic L 9.83 34 Pimozide antipsychotic L 9.39 34 Hoechst 33342 DNA L 7.44 35 Peptide phosphonates Carboxypeptidase IM 11.52 35 Argatroban Thrombin I 7.72 35 Peptide derivative Thermolysin I 7.29 36 Cyclic-aza isostere HIV protease I 10.15 36 Benzodiazepines Integrin L 8.55 36 Cyclic urea HIV protease I 8.37 37 Peptide phosphonates Carboxypeptidase IM 11.40 37 Cyclic-aza isostere HIV protease I 9.31 37 Benzodiazepines Integrin L 8.80 38 Hydroxypyrone HIV protease I 10.22 38 Cyclic urea HIV protease I 9.92 38 Benzodiazepines Integrin L 8.40 39 Cyclic sulfone HIV protease I 9.52 39 Benzodiazepines Integrin L 7.05 40 Cyclic-aza isostere HIV protease I 11.30 40 Hydroxy pyrone HIV protease I 11.16 Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)

  26. experimentelle Protein-Liganden Affinitäten # Atome Ligand Target Typ    log K1 41 Peptide phosphonates Carboxypeptidase IM 12.00 41 Cyclic urea HIV protease I 9.48 41 Cyclic sulfone HIV protease I 9.22 42 Hydroxypyrone HIV protease I 11.10 42 Cyclic urea HIV protease I 9.85 43 Peptide phosphonates Carboxypeptidase IM 13.96 43 Cyclic urea HIV protease I 9.48 43 Cyclic sulfone HIV protease I 9.00 44 Cyclic urea HIV protease I 10.41 45 Serotonin dimer 5-Hydroxy tryptamine receptor L 10.05 46 Cyclic urea HIV protease I 10.75 46 Cyclic urea HIV protease I 9.51 47 Zaragozic acid A Squalene synthase I 10.11 48 Cyclic urea HIV protease I 10.35 50 Cyclic urea HIV protease I 10.20 50 Hydroxyethyl amine derivative Cathepsin D I 7.85 51 Zaragozic acid B Squalene synthase I 10.54 51 Combichem hydroxyethyl amine derivative Cathepsin D I 8.05 52 Cyclic urea HIV protease I 9.37 54 Cyclic urea HIV protease I 10.57 54 Combichem hydroxyethyl amine derivative Cathepsin D I 7.23 55 Peptide-based Thrombin receptor L 7.40 56 Cyclic urea HIV protease I 10.37 56 Peptide-based Thrombin receptor L 7.92 58 Cyclic urea HIV protease I 10.96 60 Cyclic urea HIV protease I 10.80 62 Cyclic urea HIV protease I 10.62 64 Cyclic urea HIV protease I 10.07 64 Acetyl-CoA Acetyl-CoA carboxylase I 8.00 67 Peptide-based Thrombin receptor L 8.10 68 Stearyl-CoA Acetyl-CoA carboxylase I 8.89 Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)

  27. Bindungsaffinität •  Metallionen oder Metalloenzyme •  kleine Anionen •  natürliche Liganden • Enzyminhibitoren linearer Anstieg der freien Bindungsenthalpie zu Beginn bis ca. 15 Nicht-H-Atome • Gbinding = - 60 kJ mol-1 maximal. Dann wird Sättigung beobachtet. Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)

  28. Interpretation Metallionen und Anionen binden am stärksten. Nanomolekulare Liganden können bereits mit 7-10 Atomen erreicht werden. Grössere Liganden - besitzen üblicherweise nur eine kleine Zahl polarer Atome pro Molekül - die elektrostatischen Gruppen der Bindungsstelle werden zunehmend im Inneren begraben - sind oft elektrisch neutral - besitzen mehr entropische Freiheitsgrade -G pro Atom Kuntz, Chen, Sharp, Kollman, PNAS 96, 9997 (1999)

  29. Wie kann man die Bindungsaffinität verbessern? Es gibt 2 Strategien zum Design von stark bindenden Inhibitoren: (a) kombinatorische Strategien (b) rationale Strategien. Beide Strategien erlauben es in der Praxis effizient Lead-Moleküle mit geringer Affinität zu finden; beide sind ineffizient und unzuverlässig, Liganden mit hoher Affinität zu finden (nM). Anwendung der kombinierten Strategie CombiSMoG um Ligand für menschliche Carbonic Anhydrase II (HCA) zu finden. Resultat: Es wurde der stärkste bisher bekannte Ligand für HCA gefunden ( Kd = 30 pM). Grzybowski et al. PNAS 99, 1270 (2002)

  30. CombiSMoG Analyse von 1000 Protein-Liganden Komplexe in PDB  entwickle statistisches Potential zwischen Atomen des Liganden und des Proteins Kontakt ja, wenn Distanz < 5 Å Vorteile gegenüber Molekülmechanik-Kraftfeldern: (1) sehr schnell auszuwerten (2) Potentialwerte beinhalten implizit die Entropie für Wasserdesolvatation, entsprechen freien Bindungsenthalpien (3) Potential ist typisch für Protein-Liganden-Wechselwirkungen Grzybowski et al. PNAS 99, 1270 (2002)

  31. CombiSMoG-Algorithmus Dunkelgrünes Fragment wird in Bindungstasche positioniert. Weiteres Fragment aus einer Bibliothek mit 100 organischen Substanzen (blau) wird angefügt. Winkel wird in 60° Schritten optimiert. Fragment wird akzeptiert, wenn neuer Gesamt-Score besser als der alte ist bzw. entsprechend einer Monte-Carlo- Zufallsentscheidung. Die Suche nach weiteren Fragmenten wird fortgesetzt bis Abbruchbedinung erreicht wird (z.B. maximale Anzahl an Nicht-H-Atomen erreicht, z.B. 30). Methode kann 50.000 Strukturen pro Tag generieren.

  32. kombinatorisches Liganden-Design Strukturen der 5 Liganden mit den besten Scores. In Klammer die Bewertung nach Optimierung mit dem CHARMM-Kraftfeld. Die lila und hellblauen Moleküle wurden synthetisiert und ihre Kristallstruktur mit HCA bestimmt. Geeignetes Startfragment mit KD = 120 nM um WW mit Zink-Ion zu vermeiden. (H2NO2S-Gruppe hat Kontakt mit Zn2+).

  33. Spektakulärer Erfolg für theoretisches Liganden-Design Vorhergesagte Orientierung der R- und S-Stereoisomere In gelb ist jeweils die Kristallstruktur gezeigt. Oben und unten in B sind zwei verschiedene Ansichten gezeigt.

  34. Korrelation von CombiSMoG Scores mit exp. Daten Korrelation für Inhibitoren von HCA, 80 Liganden für für die Kristallstrukturen vorliegen asp: Aspartic Protease met: Metalloproteine misc: ser: Serin-Proteasen sug: Zucker-bindende Proteine

  35. Eine konkrete Studie an einem biologischen System –oft kommt es anders als man denkt. Gu, W., Kofler, W., Antes, I., Freund, C., Helms, V. (2005) Biochemistry, 44, 6404-6415. Alternative Binding Modes of Proline-rich Peptides Binding to the GYF-Domain.

  36. Why are proline-rich sequences special? • Repetitive proline-rich sequences are found in many proteins and in many cases are thought to function as docking sites for signaling modules. • Why might proline be singled out for recognition by so many key protein-protein interaction modules? • Several features of proline distinguish it from the other 19 naturally • occurring amino acids (Fig. 1A): • the unusual shape of its pyrrolidine ring • the conformational constraints on its dihedral angles imposed by • this cyclic side chain • its resulting secondary structural preferences • its substituted amide nitrogen, • and the relative stability of the cis isomer in a peptide bond. • Each recognition domain exploits some combination of these distinctive features of proline in order to achieve specific binding to proline-rich regions. Zarrinpar, A., Bhattacharyya, R. P., and Lim, W. A. (2003) The structure and function of proline recognition domains, Sci. STKE.RE8.

  37. Properties of PPII helices (B) Schematic and structural representation of a PPII helix. The helix has twofold pseudosymmetry: A rotation of 180° about a vertical axis leaves the proline rings and the carbonyl oxygens at approximately the same position. The Protein Data Bank (PDB) accession code for the poly-(l)-proline structure shown is 1CF0. (C) A view down the axis of the PPII helix highlighting the position of the carbons in the xP dipeptide. In the “x” position that requires C-substitution (blue), the primary recognition element is the β carbon, whereas in the “P” position that requires N-substitution (red), the primary recognition element is the δ carbon that is unique to proline. Zarrinpar, A., Bhattacharyya, R. P., and Lim, W. A. (2003) The structure and function of proline recognition domains, Sci. STKE.RE8.

  38. Structure and binding mechanism of SH3 domains structure of the Sem5 SH3 domain cartoon of the proline-binding surface in complex with a proline-rich ligand (1SEM). Core recognition surface: yellow: two xP binding grooves formed by aromatic amino acids green: less conserved specificity pockets Zarrinpar, A. et al. (2003)

  39. Structure and binding mechanism of WW domains 1EG4 Core recognition surface: yellow: xP binding groove formed by aromatic amino acids green: less conserved specificity pockets. Zarrinpar, A. et al. (2003)

  40. Structure and binding mechanism of EVH1 domains 1EVH Core recognition surface yellow: conserved set of aromatic residues system is different from other PRS-binding domains Zarrinpar, A. et al. (2003)

  41. Structure and binding mechanism of a GYF domain 1L2Z Core recognition surface: yellow: xP binding groove formed by aromatic amino acids green: less conserved specificity pockets. Zarrinpar, A. et al. (2003)

  42. Identification of a novel “register-shifted” binding mode NMR structure of GYF domain with wild-type peptide. The GYF domain is represented by its molecular surface; the peptide atoms are drawn as sticks. Residues forming the binding pocket are coloured in dark grey and labelled by their one-letter codes and sequence numbers. Gu et al. Biochemistry, in press (2005)

  43. What is the conformation of the unbound peptide Gu et al. Biochemistry, in press (2005)

  44. Study conformation of unbound peptide Evolution of the backbone dihedral angles (black: Phi angles; red: Psi angles) during the MD simulation of the wild-type peptide (a) and the mutant peptide (b). Ideal values of the dihedral angles are shown in solid lines (blue: Phi angles; green: Psi angles). Gu et al. Biochemistry, in press (2005)

  45. Unbound peptides have PPII helical conformation Superposition of the representative conformations of simulations of unbound peptides (from left to right: WT, WTE, G8W and H9M) onto the bound peptide in the NMR structure. Representative conformations are colored in black while the bound peptide in the NMR structure is shown in grey. Gu et al. Biochemistry, in press (2005)

  46. Which residues are crucial for binding? Substitution analysis of the SHRPPPPGHR peptide binding to the GYF domain. All single substitution analogues of the peptide were synthesized on a cellulose membrane. The single letter code above each column marks the amino acid that replaces the corresponding wild-type residue, while the row defines the position of the substitution within the peptide. Spots in the most left column (WT) have identical sequences and represent the wild type peptide. The membrane was incubated with a GST-GYF construct of CD2BP2. Bound protein was detected with an anti-GST primary antibody and a horse-radish peroxidase coupled secondary antibody. The relative spot intensities correlate qualitatively with the binding affinities Conclusion: Two central prolines are critical and the following glycine. But can this glycine be mutated to Trp? Gu et al. Biochemistry, in press (2005)

  47. Binding analysis of Trp-peptide mutant Binding analysis of the CD2BP2-GYF domain to the peptide SHRPPPPWHRV in comparison to the wild-type peptide SHRPPPPGHRV by NMR. (a) The sum of the weighted geometrical differences of the chemical shifts (Geometric sum of chemical shift changes) for assigned peaks, which could be identified at all applied peptide concentrations is plotted against the concentration of the peptide. (b) Mapping of the binding site of SHRPPPPGHRV and SHRPPPPWHRV peptides onto the CD2BP2-GYF domain. Overlay of HSQC spectra of GYF domain alone (green) and GYF-domain in the presence of a 10-fold excess of the wild-type peptide SHRPPPPGHRV (blue) or the mutant peptide SHRPPPPWHRV (red), respectively. Gu et al. Biochemistry, in press (2005)

  48. MD simulation of GYF:domain complexes Comparison of the binding interfaces of the GYF domain (NMR and simulation) for the wild-type complex (above) and of the H9M mutant (below). The GYF domain is represented by its molecular surface and coloured by position (from orange to deep blue: completely buried to completely exposed); the peptide atoms are drawn as sticks and coloured according to their appearance in sequence. Gu et al. Biochemistry, in press (2005)

  49. Trp-peptide mutant shows “register shift” (a) Superposition of the two binding modes found in the simulation of the G8W mutant complex (starting from the docking results). The two conformations of the peptide are drawn as sticks (blue: mode 1, red: mode 2, pink: Pro6 and Pro7 in mode 1, yellow: Pro6 and Pro7 in mode 2). (b) Binding mode of the G8R mutant complex (representative conformation of the simulation). The peptide atoms are represented by sticks and coloured according to their sequence number. In (a) and (b), the GYF domain is represented by its molecular surface and coloured by position (from orange to deep blue: completely buried to completely exposed) and Pro6 and Pro7 are labelled by their one-letter codes and sequence numbers. Mode 2 is labelled as “(alt)”. (c) Superposition of the representative conformations of the five simulations of wild type GYF complex starting from the alternative binding mode. Pro6 and Pro7 are represented by sticks and are labelled by their one-letter codes and sequence numbers. Pro6 is coloured in light grey and Pro7 is coloured in dark grey. (d) The translation and rotation motions of the peptide between the two binding modes (blue: mode 1, red: mode 2, pink: Pro4 to Pro7 in mode 1, yellow: Pro4 to Pro7 in mode 2). For Pro4 to Pro7 a rotation is the principle component of motion, while for other residues in the peptide a translation is the principle component of motion. Gu et al. Biochemistry, in press (2005)

  50. register-shift hypothesis supported by experiments Substitution analysis of the SHRPPPPWHR peptide binding to the GYF domain. All single substitution analogues of the peptide were synthesized on a cellulose membrane. The single letter code above each column marks the amino acid that replaces the corresponding wild-type residue, while the row defines the position of the substitution within the peptide. Spots in the most left column (WT) have identical sequences and represent the wild type peptide. The membrane was incubated with a GST-GYF construct of CD2BP2. Bound protein was detected with an anti-GST primary antibody and a horse-radish peroxidase coupled secondary antibody. The relative spot intensities correlate qualitatively with the binding affinities Gu et al. Biochemistry, in press (2005)

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