TRAPIANTO DI CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE

1. TRAPIANTO DI CELLULE STAMINALI EMOPOIETICHE

3. La cellula staminale emopoietica (CSE) E’ in grado di: automantenersi (self-renewal) differenziare mobilizzare al di fuori del midollo osseo andare incontro ad apoptosi

4. Sorgenti di CSE Midollo osseo Sangue periferico Autologhe Midollo osseo Sangue periferico Sangue placentare Allogeniche

5. TCSE: donatori • Fratello HLA-identico (sibling) • Donatore volontario non correlato (matched unrelated donor – MUD – volunteer unrelated donor – VUD -):HLA-identico HLA-mismatched per 1/2 Ag Gemello identico (singenico) adulto sangue cordonale • Donatore familiare aploidentico

6. Searching and identifying an alternative HSCT donor U-BMT U-CBT HAPLO Median search time 3-4 mths <1 mth 0 Donors identified but not available 10-20% 1% 0% Rare haplotypes represented 2-10% 20% 100% Limiting factors to graft acquisition HLA match Cell dose Donor mobil./TCD Viral transmission to recipient Yes No Yes Risk to donor Yes No Yes T-cell related GVL effect Yes Yes No NK related GVL effect Rarely No ? In some cases Potential for DLI Yes No Limited Memory T-cells Yes No No

7. TCSE autologo: manipolazione in laboratorio • Purging (LAL, LAM) • Selezione (tumori solidi): selezione positiva (CD34+) selezione negativa (GD2 in NB) • Deeritrocizzazione • Deplasmazione • T-deplezione • Valutazione del contenuto in CD34+ • Prove di vitalità • Prove di clonogenicità

8. TCSE allogenico: manipolazione in laboratorio Incompatibilità AB0 maggiore: donatore ricevente A, B, AB 0 A B A AB B A B AB Incompatibilità ABO minore: 0 A, B, AB Deeritrocizzazione Deeritrocizzazione + Deplasmazione Deplasmazione

9. TCSE allogenico: manipolazione in laboratorio • T-deplezione (aploidentico) • Selezione positiva delle CD34+ (aploidentico) • Valutazione del contenuto in CD34+ • Prove di vitalità • Prove di clonogenicità

10. TCSE: regimi di condizionamento • Regime di condizionamento convenzionale • Regime di condizionamento ad intensità ridotta • Regime di condizionamento non mieloablativo

11. Regime di condizionamento convenzionale Associazione chemio-radioterapica alla massima dose tollerabile in funzione di una tossicità extramidollare allo scopo di: Creare lo spazio midollare per l’attecchimento dell’inoculo (++++Allo; + Auto) Determinare un’immunosoppressione tale da impedire il rigetto del trapianto (++++ Allo) Eradicare il clone neoplastico (++ Allo; ++++ Auto)

12. Regime di condizionamento a intensità ridotta Associazione chemioterapica, contenente in genere fludarabina, a scopo immunosoppressivo, ma scarsamente mieloablativo. In caso di rigetto del trapianto, consente una ripresa dell’emopoiesi autologa, anche se in tempi più lunghi rispetto ad un regime non mieloablativo.

13. Regime di condizionamento non mieloablativo • Radioterapia o associazione di chemioterapici a scopo immunosoppressivo, non mieloablativo con l’obiettivo di: • Garantire l’attecchimento dell’inoculo • Potenziare l’effetto GvT esercitato dai linfociti del donatore • Ridurre tossicità e mortalità trapianto correlate

14. Non-mieloablativo: Immunosoppressivo per evitare il rigetto e consentire l’attecchimento Non-mieloablativo: effetto Graft versus Tumor Non-mieloablativo: effetto Graft versus Marrow TCSE non mieloablativo Convenzionale: Immunosoppressivo per evitare il rigetto e consentire l’attecchimento Mieloablativo per eliminare cellule maligne residue Mieloablativo per creare spazio all’interno del midollo

15. TCSE autologo: razionale • Ricostituzione di una normale funzione ematopoietica alterata da: • Patologia a carico della cellula staminale emopoietica • Occupazione del tessuto osseo da parte di malattia neoplastica LAM in I/II RC, LAL in II RC dopo ric. extra-BM Linfomi ric. o res., invasione midollare da parte di cellule neoplastiche

16. TCSE autologo: razionale • Controllo della patologia: • Neuroblastoma IV stadio • Sarcoma di Ewing alto rischio • Tumori solidi in fase avanzata: • tumori cerebrali • rabdomiosarcoma • tumore di Wilms • tumori a cellule germinali • Malattie autoimmuni

17. TCSE allogenico: razionale • Ricostituzione di una normale funzione ematopoietica alterata da: • Patologia a carico della cellula staminale emopoietica leucemie acute e croniche aplasia midollare anemia di Blackfand-Diamond anemia falciforme beta-talassemia SCID WAS errori congeniti del metabolismo Sindrome di Hurler Sindrome di Hunter Sindrome di Lesch Nyhan Osteopetrosi

18. TCSE allogenico: razionale • Controllo della patologia: • Controllo della crescita neoplastica • Immunoterapia leucemie acute e croniche linfoma di Hodgkin linfomi non Hodgkin tumori solidi in fase avanzata: neuroblastoma IV stadio sarcoma di Ewing alto rischio rabdomiosarcoma

19. Graft versus Tumor La reazione GvT è mediata dai linfociti T del donatore ed è legata a differenze tra donatore e ricevente nell’ambito degli antigeni del sistema HLA e degli antigeni minori di istocompatibilità. Tali antigeni sono tuttavia espressi anche su tessuti normali dell’ospite: GvH. Un ulteriore possibile meccanismo potrebbe includere una reazione dei linfociti nei confronti di non ben definiti antigeni tumore specifici (Tumor-Associated Antigen -TAA).

20. Graft versus Tumor Anche le cellule NK, che appartengono al compartimento dell’immunità innata, possono rivestire importanza nell’induzione della GvT, essendo attivate da un’alterata o assente espressione delle molecole HLA di classe I alla superficie cellulare: ipotesi del “missing self”. In questo modo, le NK non sarebbero coinvolte nella genesi della GvH, non attaccando i tessuti con normale espressione di molecole HLA di classe I, ma solo della GvT.

21. Cellule Natural Killer Le NK esprimono gruppi differenti di recettori, inibitori ed attivatori. Tra questi, i KIR riconoscono epitopi (ligandi KIR) condivisi da gruppi di alleli HLA di classe I. La mancata espressione del corretto ligando KIR di classe I sulle cellule allogeniche mis-matched scatena l’alloreattività NK. In particolare, gli alleli HLA-C hanno dimostrato un ruolo primario del meccanismo di protezione delle cellule dalla citotossicità NK.

22. TCSE aploidentico Necessità di T-depletare per ridurre il rischio di GvHD Probabilità e rapidità nel reperimento di un donatore • Aumentato rischio di recidiva • Aumentato rischio di rigetto • Intensa immunosoppressione

23. Cellula autologa Natural Killer KIR2DL1 HLA-CLys80(Cw2,4,5,6,.. “gruppo 2”HLA-C) KIR2DL 2/3 HLA-CAsn80(Cw1,3,7,8,.. “gruppo 1”HLA-C) C KIR3DL1 HLA-Bw4 alleli < [

24. Ricevente Target Donatore HLA NK cell KIR2DL1 HLA-C group 2 Cw2 HLA-C group2 Cw2 [ ] KIR2DL 2/3 HLA-C group1 Cw1 HLA-C group 2 Cw4 C C missing HLA-C group1 KIR3DL1 HLA-Bw4 B27 HLA-Bw4 B51 > <

25. NK nel TCSE aploidentico L’infusione di cellule NK alloreattive si associa a tre importanti fenomeni: distruggendo le cellule T dell’ospite, primariamente deputate al rigetto del trapianto, si riduce l’incidenza di questa complicanza; attaccando prevalentemente le cellule ematopoietiche, non si assiste al fenomeno della GvHD; distruggendo le APC dell’ospite, deputate alla presentazione dell’antigene ai linfociti T del donatore e quindi all’innesco della reazione GvH, si realizza un effetto protettivo nei confronti di questa complicanza.

26. NK nel TCSE aploidentico Evidenze che l’alloreattività NK non ha come bersaglio altri tessuti al di fuori delle cellule linfoematopoietiche suggeriscono che l’infusione pre-TCSE di NK alloreattive possa essere utilizzata con sicurezza nel regime di condizionamento del paziente. Esperimenti in modelli murini indicano che l’alloreattività NK in direzione GvH può promuovere un’immunosoppressione e mieloablazione tali da consentire l’innesto di midollo osseo MHC incompatibile senza sviluppo di GvHD, usando un regime di condizionamento non letale.

27. Donor Lymphocyte Infusion Bulk Dose Regimen vs Escalating Dose Regimen 1,5 x 108/kg 1075 x 107 108/kg Obiettivo: indurre un effetto di Graft versus Tumor Effetti collaterali: induzione di GvHD aplasia ed immunosoppressione

28. CTL anti-leucemia Identificazione di antigeni presenti sulle cellule tumorali in grado di stimolare linfociti T citotossici (CTL) specifici per le cellule maligne e scarsamente reattivi verso i tessuti sani dell’ospite. Espansione di CTL dotati di: • efficiente funzione effettrice in vivo • memoria immunologica a lungo termine

29. CTL anti-Epstein Barr virus CTL EBV-specifici del donatore CTL EBV-specifici autologhi: ottenuti prima del TCSE e criopreservati ottenuti al momento della diagnosi di EBV-LPD Il trattamento preventivo è da preferire per i minori effetti collaterali e le maggiori probabilità di successo

30. CD4+ anti-CMV ed Aspergillus I linfociti T del donatore vengono messi in coltura con Aspergillus fumigatus or CMV, e viene aggiunta IL-2 nelle prime due settimane. Si ottengono solo cloni CD4+ producenti IFN-gamma. I cloni vengono valutati per la cross-reattività nei confronti del paziente.

31. TCSE e cellule mesenchimaliMatched-pair analysis Osiris-EBMT 2002 • L’infusione di MSC espanse in associazione con le CSE: • riduce l’incidenza di GvHD acuta e cronica • migliora DFS and OS • non sembra influire sull’incidenza di recidive

32. TCSE: nuove frontiere Espansione ex-vivo di CSE da CB per trapianto nell’adulto Malattie autoimmuni non-organo specifiche Malattie autoimmuni organo specifiche (DM) Infarto miocardico acuto (IMA) Distrofia muscolare di Duchenne Patologie degenerative SNC

33. TCSE e malattie autoimmuni Razionale Distruggere le cellule immuni autoreattive e ricostituire un sistema immunitario correttamente funzionante. Modalità Mobilizzazione delle CSE autologhe mediante somministrazione di G-CSF; raccolta aferetica delle CSE; separazione delle CSE dal prodotto aferetico e congelamento.

34. TCSE e malattie autoimmuni Problemi aperti Rischio di riacutizzazione della malattia di base in corso di trattamento con G-CSF Immunosoppressione post-SCT Difficoltà di selezionare un numero adeguato di CS Rischio di inoculare cellule mature autoreattive Malattie autoimmuni organo-specifiche (DM, AR)

36. CSE e diabete mellito Obiettivi: arrestare il processo autoimmune favorire la riparazione degli organi danneggiati La natura monocellulare della patologia lo rende un terreno ideale per la terapia cellulare: colture di CS che differenzino in cellule insulari terapia genica

37. Terapia genica Nell’ambito delle malattie autoimmuni organo-specifiche, l’obiettivo primario è quello di modificare la risposta immune infiammatoria aberrante: • geni per l’espressione di recettori alterati per le citochine infiammatorie; • geni per la secrezione di citochine anti-infiammatorie. Modificazione genetica di cellule allo scopo di ottenere un effetto terapeutico

40. CSE e plasticità Le CSE sono in grado di differenziare in numerosi tipi cellulari non emopoietici, e possono quindi promuovere una ripresa funzionale e strutturale a livello di vari organi ed apparati, tra cui: fegato, reni, pancreas, polmone, cute, tratto gastroenterico, cuore, apparato muscolo-scheletrico, tessuto nervoso.

42. TCSE nell’IMA Iniezione intracoronarica di cellule CD133+ autologhe dopo IMA. Razionale Possibilità che CS purificate dal BM o dal PB abbiano effetto terapeutico in pz che abbiano di recente subito un importante danno transparietale per IMA con associati marker prognostici negativi di ricostruzione per danno microvascolare.

45. TCSE nella degenerazione maculare L’azione angiogenetica delle cellule infuse attualmente rappresenta un limite importante all’applicazione nell’uomo Trapianto di cellule CD34+ autologhe. Razionale Vi sono alcune evidenze sul potenziale differenziativo delle CS di derivazione midollare in cellule retiniche in modelli murini.

47. TCSE nelle patologie SNC Sclerosi multipla Il TCSE sembra in grado di sopprimere la componente infiammatoria della SM; le CSE possono migrare nel SNC e differenziare in cellule che esprimano marker neurali e gliali; Le CSE possiedono inoltre un potenziale rigenerativo neurale e mielinico. Parkinson Stroke

48. TCSE nella distrofia muscolare di Duchenne Trapianto di cellule CD133+ autologhe nella distrofia di Duchenne. Razionale Le CS muscolari trapiantate nel topo distrofico possono dare origine a miociti scheletrici differenziati. Le cellule CD133+ derivate dal muscolo di pz con Duchenne possono differenziare in vivo in miociti.

49. Espansione di CSE ex-vivo L’espansione delle cellule in coltura può essere >100 volte in 1-2 settimane; il potenziale di espansione delle cellule più immature è tuttavia molto più limitato (2-20 volte). Ruolo chiave delle citochine nel prevenire la differenziazione terminale delle CS. Obiettivi: ottenere un numero di CSE adeguato per la procedura trapiantologica manipolazione nell’ambito della terapia genica