Utilização de Polimorfismos em Análises Forenses

1. Utilização de Polimorfismos em Análises Forenses Luciana Otero Lima - Março/2006-

3. Relembrando... • Polimorfismo Genético É a coexistência de alelos múltiplos em um lócus cromossômico; regiões do genoma nas quais existem variações entre as pessoas. • Polimorfismo de sítio de restrição (RFLP) • Polimorfismo de nucleotídeo único (SNP) • Polimorfismos de inserção/deleção (indels) • Polimorfismos de minissatélites (VNTR) • Polimorfismos de microssatélites (STR)

4. Qual a importância desses polimorfismos? • Fonte de variabilidade; • Permitem construir um perfil genético indivíduo-específco  “DNA fingerprint”; importante em Medicina Forense

5. Por que analisar tais polimorfismos no DNA? • Determinação de paternidade; • Resolução de casos criminais envolvendo: • Estupro; • Homicídio; • Rapto; • Troca ou abandono de crianças.

6. De onde pode ser extraído o DNA? • Sangue  padrão-ouro; • células epiteliais da mucosa oral: saliva, pontas de cigarro, selos e envelopes, gomas de mascar, copos, tampas de caneta mordidas,...; • Pêlos e fios de cabelo (com ou sem o bulbo capilar); • Unhas; • Esfregaços;

7. De onde pode ser extraído o DNA? • Manchas de material biológico: líquido seminal, urina, saliva, sangue; • Tecidos de biópsias cirúrgicas; • Ossadas (carbonizadas ou não); • Tecidos mumificados ou congelados; • Células deixadas por impressão digital; • Dentes; • outras

8. Como extrair o DNA? • Técnicas específicas para cada tipo de amostra; • CUIDADO: O sucesso da tipagem de DNA depende basicamente da qualidade e quantidade de DNA extraído

9. Métodos disponíveis para utilização: • VNTRs estudados com sondas multilocais; • STRs estudados com PCR; • DNA mitocondrial (mtDNA); • STRs do Cromossomo Y; • Técnicas mais recentes.

10. VNTRs estudados com sondas multilocais • Princípio do método: após clivagem por endonucleases, cada indivíduo tem um padrão de bandas específico com tamanhos determinados pela presença, ou não, do sítio da enzima e pela quantidade de repetições em tandem. Para que possa-se visualizar, esses fragmentos devem ser hibridizados a sondas radioativas de seqüência invariável.

11. VNTRs estudados com sondas multilocais

12. VNTRs estudados com sondas multilocais • Técnica de custo razoável; • DNA não degradado; • Quantidade suficiente de DNA; • Várias dificuldades inerentes à técnica.

13. VNTRs estudados com sondas multilocais • Teste de paternidade:

14. Identificação de um criminoso:

15. STRs estudados com PCR • Princípio do método: Reação de PCR utilizada para copiar extensivamente várias regiões de STR, fornecendo fragmentos de tamanhos diferentes visualizados por eletroforese em gel de poliacrilamida ou por seqüenciamento

16. STRs estudados com PCR

17. Retirado de “Os exames de DNA nos Tribunais”, Revista Ciência Hoje (vol. 29, nº 169 - março/2001)

18. STRs estudados com PCR • Vantagem sobre a técnica de VNTR: como o DNA é “amplificado”, a amostra a ser analisada pode ter uma quantidade inicial muito menor. • Mesmo existindo contaminação por DNA de outras espécies, a técnica de PCR é específica o suficiente para amplificar apenas o DNA humano

19. OBS: Quantas regiões são necessárias?

20. mtDNA • Características importantes: • Também contém regiões polimórficas que permitem a “individualização”; • Descendentes recebem apenas da mãe  permite traçar a linhagem materna de uma pessoa; • É mais resistente à degradação que o DNA nuclear. • taxa mutacional do mtDNA é 5-10 vezes maior que a do DNA nuclear  poucos mecanismos de reparo permitem que as variações nos nucleotídeos sejam acumuladas

22. mtDNA • Princípio do método: Reação de PCR com o objetivo de copiar extensivamente regiões polimórficas presentes no DNA mitocondrial, analisado posteriormente por sequenciamento

23. mtDNA

24. mtDNA • Utilizado quando a amostra em questão tem uma quantidade pequena ou não tem DNA nuclear;

25. mtDNA • Utilizado na identificação de corpos em grandes desastres comparar a seqüência de interesse com a obtida nos possíveis irmãos ou ascendentes maternos; • Identificação de maternidade sem o pai (p/ filhos e filhas) • Não identifica um indivíduo específico; • Estudos históricos ou evolutivos.

26. STRs crY • Características importantes: • Também contém regiões polimórficas que permitem a “individualização”; • Homens recebem apenas do pai  permite traçar a linhagem paterna de um homem; • Crossing-over com o crX em regiões homólogas entre os 2 cromossomos.

28. STRs crY

29. STRs crY • Identificação de paternidade sem o pai (p/ filhos); • Elucidação de estupro (mistura de DNA); • Não identifica um indivíduo específico; • Estudos históricos ou evolutivos;

30. Técnicas mais recentes • SNPs • Minisseqüenciamento; • São muito numerosos; • Baixa taxa de mutação; • Requer maior nº de marcadores; • Indels  Estudados em produtos de amplificação muito curtos (50pb ou menos)  vantagem sobre STRs em estudos de DNA extremamente degradado (ex: cadáver em estado avançado de decomposição ou carbonizado)

31. E no futuro... • Bancos completos de perfil de criminosos OBS: • Inglaterra • CODIS – Combined DNA Index System (1994) • Amostra de DNA  “retrato falado”