MŰSZERES ANALITIKAI KÉMIA ELVÁLASZTÁSTECHNIKA Vegyész szak 2007. I. félév Zsigrainé dr. Vasa

1. MŰSZERES ANALITIKAI KÉMIA ELVÁLASZTÁSTECHNIKA Vegyész szak 2007. I. félév Zsigrainé dr. Vasanits Anikó

2. Követelmények II. éves vegyész BSc és III. éves vegyész „Műszeres analitika” tantárgyból Előadás: a „Tanulmányi és vizsgaszabályzat” szerint az előadásokon való részvétel nem kötelező, de ajánlott, hiszen a vizsgaanyaga döntően az előadások anyaga. Az első előadáson ismertetjük a féléves tematikát. Vizsgafeltétel: az „Az analitikai kémia” (kv1n1an1) előzetes teljesítése!!!! Vizsga: A hallgatók külön szóbeli vizsgát tesznek (egyazon vizsganapon) a „Spektroszkópia” és külön az „Elválasztástechnika” tananyagból, mely érdemjegyek átlagából kapják a végső jegyet. Valamelyik részvizsga elégtelenre való teljesítése esetén, a vizsgajegy elégtelennek számít. A sikertelen vizsga ismétlése a TVSZ előírásai szerint történik. Hármas, vagy annál jobb részvizsgát nem kell ismételni.

3. Irodalom • Burger Kálmán: Az analitikai kémia alapjai: Kémiai és műszeres elemzés, Semmelweis kiadó 1999, vagy ALLITER 2002. 489-511, 567-603. • Pokol György – Sztatisz Janisz: Analitikai kémia I. 15 - 18. fejezet Műegyetemi Kiadó, 1999 • Dr. Mádi Istvánné: Elválasztástechnika (KLTE) Nemzeti tankönyvkiadó, 1993 • Kremmer Tíbor, Torkos Kornél Elválasztástechnikai módszerek elmélete és gyakorlata Akadémiai Kiadó, 2010 • Weboldalak http://www.chem.elte.hu/departments/anal/vasanits/

4. Weboldalak Animációk: http://www.instrumentalchemistry.com/theory/index.htm http://www.shsu.edu/~chm_tgc/sounds/sound.html http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/ http://www.chromatography.amershambiosciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/50C849D0D5B16BA0C1256E92003E865B?OpenDocument http://www.chromatography.amershambiosciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/AD018C9E293F99BEC1256E92003E865A?OpenDocument http://www.chromatography.amershambiosciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/4A555D526B88731AC1256E92003E865C?OpenDocument http://www.chromatography.amershambiosciences.com/aptrix/upp00919.nsf/Content/281C4717F50A3605C1256E92003E865D?OpenDocument IONKROMATOGRÁFIA: http://epa.oszk.hu/00000/00025/00003/ionmeghat.html AFFINITÁS KROMATOGRÁFIA: http://users.rcn.com/jkimball.ma.ultranet/BiologyPages/A/AffinityChrom.html

5. GÁZKROMATOGRÁFIA: http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/GC/ http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/gc/ http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/capillary/ HPLC: http://ull.chemistry.uakron.edu/analytical/LC/ http://hplc.chem.shu.edu/HPLC/index.html http://ull.chemistry.uakron.edu/chemsep/lc_equip/ MS: http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/ http://www.chm.bris.ac.uk/ms/theory/apci-ionisation.html http://www.chem.ox.ac.uk/spectroscopy/mass-spec/Lecture/oxlectureMALDI.html http://www.newobjective.com/electrospray/ MINTAELŐKÉSZÍTÉS http://epa.oszk.hu/00000/00025/00006/fekete.html

6. Elválasztástechnika KROMATOGRÁFIA: Speciális fizikai-kémiai, analitikai és preparatív elválasztási módszerek összessége, oldatban levő, vagy gázhalmazállapotú, sokkomponensű elegyek összetevőinek egymástól való elkülönítésére. Általános alapelv: Egy keverék komponenseinek két egymással nem elegyedő fázis (álló- és mozgófázis) közötti anyagátmenet, valamint az egyes alkotóknak az álló- és mozgófázissal való eltérő kölcsönhatása.

7. Álló- és mozgófázis • Állófázis: - szilárd, - folyékony, de mindenképpen helyhez kötött. • Mozgófázis: - gáz  gázkromatográfia - folyadék  folyadékkromatográfia - szuperkritikus folyadék  szuperkritikus fluid kromatográfia A fázisok közötti anyagátmenet dinamikus jellegű. Minta „útja”: mozgó fázis  állófázis  új mozgó fázis új állófázis

8. Kromatogram kialakulása

9. Csúcs elúciós profil Ki = ci,s ci,m

10. Dinamikus egyensúly jön létre.Időegység alatt az állófázisba bejutott molekulák (atomok, ionok) száma = időegység alatt a mozgó-fázisba jutott részecskék száma (egy másik pontján a rendszernek). Speciális kölcsönhatások a minta és az állófázis között: a, Fizikai - adszorpció, - abszorpció (megoszlás). b, Kémiai - másodlagos kötőerők, - sav-bázis kölcsönhatások. c, Biológiai - enzim-szubsztrát kapcsolat

11. Adszorpció • Egy gáz, folyadék vagy szilárd réteg képződése egy szilárd anyag, vagy ritkábban egy folyadék felszínén. A létrehozó erők természetétől függően két típusát különböztetik meg. A kemiszorpció egyetlen réteget képez a molekulákból, atomokból vagy ionokból, amelyek az adszorbeáló felülethez kémiai kötéssel kapcsolódnak. A fiziszorpció esetén az adszorbeált molekulákat gyengébb, van der Waals erővel kötődnek.

12. A kromatográfiás módszerek csoportosítása

13. ADSZORPCIÓS KROMATOGRÁFIA Elválasztás alapja: Egy bizonyos fázisban oldott keverék egyes összetevői a másik fázis határfelületén koncentráció különbségeket mutatnak. Eltérő adszorpciós koefficiensek → koncentráció különbség a fázishatáron. Elrendezés: szilárd adszorbens  folyékony-, vagy gáz mozgófázis (oszlopban, síklapon) Az összetevők eltérő adszorpciója az adszorbens részecskék felületén → a komponensek a mozgófázissal fokozatosan távoznak, eluálódnak.

14. Adszorbeált anyag és adszorbens közötti kölcsönhatás • Koordinatív kötés • Másodlagos kötőerők (diszperziós, dipól-dipól és H-híd) • DE! Kemiszorpció- kovalens kötés kialakulása kerülendő

15. Adszorpciós egyensúly jellemzése az adszorpciós együtthatóval KA~c2 állófázis c1 mozgófázis

16. Adszorbensek jellemzése • Megfelelő szemcseméret. • Szilárdság. • Nagy felület (≥100 m2/g). • Egyenletes pórusméret. • Egyenletes szemcsealak, lehetőleg szabályos gömböcskék. • Oldhatatlan legyen a mozgófázisban. • Indifferens legyen a mozgófázissal és az elválasz-tandó vegyületekkel szemben.

17. Adszorbens kapacitása: egységnyi tömeg által adszorbeált anyagmennyiség. • Adszorbens aktivitása: kötőképesség erőssége. • Adszorbens szelektivitása: egységnyi adszorbenstömegen legnagyobb mértékben adszorbeált komponens mennyisége a többi összetevőhöz képest. • Szervetlen adszorbensek: 1, Szilikagél – legáltalánosabban használt, Si-OH felületi csoportokkal, H-híd képzése az elválasztandó anyagokkal. Gyengén savas természetű – bázisos anyagok elválasztási nehézsége.

18. O O O O

19. Kloroform adszorpciós izotermája szilikagélen, heptán oldószerben 40 w/v%

20. Két-rétegű oldószer adszorpció – etil-acetát (B) heptánban (A)

21. Etil-acetát adszorpciós izotermája szilikagélen in Heptane

22. Két-rétegű oldószer adszorpció + mintaHeptán(A)+4m/V% etil-acetát(B)+benzil-acetát(solute)

23. 2, Aluminium-oxid – bázisos jellegű Felületi Al-OH- és Al-O- -hoz kapcsolódó H-híd képzése. Szerves adszorbensek: 1, Aktívszén Növényi és állati eredetű anyagok elszenesítési terméke (fa-, dióhéj-, csont-, vér- és cukorszén). Apoláros adszorbens → nagy móltömegű, szerves vegyületek kötődnek nagyobb mértékben (aromás-, kén-, bróm-, és jódtartalmú molekulák) diszperziós kölcsönhatások révén.

24. A mozgófázis jellemezése • A minta összetevőit eltérő mértékben oldja. • A minta összetevőivel és az állófázissal ne alakuljon ki irreverzibilis kölcsönhatás. • Viszkozitása csekély legyen. ELUOTRÓP SOROK A mozgófázis elúciós készségét jellemezzük az alkalmazott rendszer függvényében (adszorbens és adszorbeált anyag). Az elúciós készség a dielektromos állandóval (ε) arányos. Sorrend: a, aluminium-oxidon (hidrofil adszorbens): hexán<<benzol<kloroform<<etil-acetát<acetonitril<etanol <metanol<víz<ecetsav b, aktívszén (hidrofób): fordított sorrend Oldószerelegyek használata. Tisztaság!

25. Kísérleti elrendezés

26. IONCSERÉS KROMATOGRÁFIA Az ioncserélők olyan szerves vagy szervetlen anyagok, amelyek poláris funkciós csoportjaik réven képesek kationjaikat vagy anionjaikat az oldatban lévőkkel kicse-rélni. Az ioncserélők általá-ban szilárd halmazállapotú anyagok, de lehetnek vízben nem oldódó folyadékok is. Az ioncserélők funkciós cso-portjai lehetnek savak (katex - kationcserélő) vagy bázisok (anex – anioncserélő).

27. Ioncserélők típusai • Ioncserélő gyanta - sztirol és divinil-benzol kopolimere Stabilak és nyomásállók. Gömb alakú részecskék (emulziós poli-merizáció). Aromás gyűrűre viszik fel kémiai reakcióval a megfelelő ioncserélő sajátságú funkcióscsoportokat.

28. Ioncserélő gyanta - sztirol és divinil-benzol kopolimere

29. Dextránalapú ioncserélők DEAE-Sephadex (dextránra kötött dietil-amino-etil). CM-Sephadex (karboxi-metil csoport). Stabilak. Vízben és szerves oldószerekben oldhatatlanok. • Szilikagél alapú ioncserélők • Módosított szilikagél, (3‹pH‹7). • Szerves polimerrel fedett szilikagél (üveggyöngy). Az 1. és 3.b fázisok azok, amelyek nyomás alatt alkalmazhatók, így kis szemcseátmérőjű töltettel töltött kolonnákban használhatók, azaz nagy hatékonysággal üzemeltethetők.

30. Módosított szilikagél

31. 4.Aluminium-oxid alapú ioncserélők Amfoter jelleg!!! A hidrált alumínium-oxid anion és kationcserélő formája

32. Gyantához kötött funkciós csoportok KATEX típusú: • Rgyanta-SO3H erősen savas • Rgyanta-COOH közepesen savas • Rgyanta-OH gyengén savas ANEX típusú: • Rgyanta-NR3OH erősen bázisos • Rgyanta-NH3OH közepesen bázisos Ioncserélő kapacitás: megkötött ellentétes töltésű ion mennyiség egységnyi tömegű tölteten (mmol/g vagy mekv./g).

33. Kationioncsere: Rgyanta-SO3H + Na+ Rgyanta-SO3Na + H+ Az oldatban lévő Na+ ionok a ioncserélő gyantára kötődnek, miközben ekvivalens mennyiségű H+ ionok kerülnek az oldatba. Eluensként híg, erős savakat használnak. Anioncsere: Rgyanta-N(CH3)3OH +Cl- Rgyanta-N(CH3)3Cl + OH- Vagyis a gyantára kötött OH- ionok szabadulnak fel. Eluensként bázisos oldatokat használnak.

34. Anioncserélők - jellemzőjük, hogy az állófázis felületén rögzített pozitív töltések találhatók az elválasztás körülményei között.Kationcserélők - jellemzőjük, hogy az állófázis felületén rögzített negatív töltések találhatók az elválasztás körülményei között. Erős anioncserélők azok, amelyek ioncserélő kapacitása független az eluens pH értékétől. Ilyenek a kvaterner-ammó-nium vegyületek (pl. trimetil-ammónium, Type I).

35. Gyenge anioncserélők, ezeknél a fázisoknál az ioncserélő kapacitása az eluens pH értékének függvénye. Ilyen csopor-tok a primer, a szekunder és tercier aminok.

36. Gyenge kationcserélők állófázis szerkezete és kapacitás függése a mozgó fázis pH értékétől

37. Ionok kötödésének erőssége függ: • Ionméret és fajlagos töltés. • Eluens jellemzőitől (víz, só, szerves oldószer elegye): • puffer ion-koncentrációja, • puffer pH-ja, • alkalmazott szerves módosítok (metanol, etanol, glicerin, butanol, acetonitril), • ellenion, mely a meghatározandó összetevővel verseng és ennek a folyamatnak az eredménye megszabja a visszatartást és a szelektivitást.

38. Anionok meghatározásakor többértékű gyenge savakat (pl. benzoesav, o-ftálsav, citromsav, borkősav) teszünk a mozgó fázisba, ezek ionos formái szolgáltatják az ellenionokat. , eluenserősség Az o-ftálsav ionizációjának és eluenserősségének függése a mozgó fázis pH értékétől

39. Kationok elválasztásakor többértékű gyenge bázisokat (pl. etilén-diamin, 2-metil-piridin) teszünk a mozgó fázisba, ezek ionos formái szolgáltatják az ellenionokat. A visszatartást megszabó folyamatok komplexképzőt és szervesbázist tartalmazó mozgó fázis alkalmazásakor

40. DETEKTÁLÁSI MÓDSZEREK • Az ionkromatográfiában fő detektálási módszer a mozgó fázis vezetésének figyelése, mérése. Az egykolonnás ionkro-matográfiában ez egy átfolyó mérőteres vezetőképességi cellát jelent. Meghatározások 95%-ában. 5 ppb – 5 ug/L kimutatási határ. • Ion folyadékkromatográfiában csak néhány ionnak van az UV, vagy a látható fénytartományban fényelnyelése. Ezek például a jodid, nitrit, nitrát, jodát, kromát, permanganát. • A kationok meghatározásánál használhatunk kolonna utáni (post column reaction) vagy kolonna előtti (precolumn reaction) származékképzést, s így színes komplexeket kapunk.

41. Két kolonnás ionkromatográfia

42. Ion elnyomás (supressed ion chromatography) ioncserés oszloppal – két kolonnás módszercél: a mozgófázis vezetőképességének csökkentése a detektálás előtt Klorid ionmérése Az ionelnyomóban (erős kation cserélő oszlop H formában)lejátszódó folyamatok, ha az eluens puffere NaHCO3, vagy Na2CO3: Gyanta-SO3-H+ + Na+ → Gyanta SO3- -Na+ + H+ H++ HCO3- → H2CO3 H++  Cl- →HCl A mozgófázis vezetőképessége csökken (Na+ → H2CO3). Az elválasztott ion vezetőképessége megnő (NaCl → HCl).

43. Kationok elválasztása anioncserélő gyantaoszlopon (Varion AB) Fémionok klorokomplexeinek elválasztása klorid-formájú anioncserélő oszlopon. Ni2+ klorokomplexe [NiCl]+ → oszlopon nem kötődik Co2+ [CoCl4]2- stabil-klorokomplex → oszlopon kötődik Klorid koncentráció növelésével eluálható az oszlopról. • Vízanalitikában a főbb ionok, különösen az anionok klorid, szulfát, stb. mérésére.!!!! • Vízlágyítás: Ca2+ és Mg2+ ionok Na+-ra cserélése. 5. Hidrofil szerves anyagok elválasztása

44. Automatikus aminosav analizátor Erősen savas kationcserélőgyantán történik az amino-savak elválasztása. • Az aminosavak kötődését nagyon sok tényező befolyásolja, alapvető szerepe a pH-nak és az ellenion koncentrációnak van. Alacsony pH-n az aminosavak kationként viselkednek. A pH növelésével egyre kevésbé, az izoelektromos pont elérésekor és magasabb pH-n egyáltalán nem kötődnek a gyantához.

45. Az aminosavakat erősen savas oldatban visszük fel az oszlopra, hogy a megkötődés azonnal bekövetkezzék. Az elúcióhoz pH 3-10 közötti pufferek széles skálája használa-tos. Az elúció leggyakrabban lépcsős gradiens elúció, azaz 3-4, fokozatosan növekvő pH-jú és ellenion koncentrációjú pufferrel történik az elválasztás. • Az oszlopról távozó eluátumban az aminosavak mennyiségét általában ninhidrines színreakcióval határoz-zák meg. A fotometrálás átfolyó küvettás detektorban tör-ténik. Az aminosavak többsége (a primer aminok) a ninhidrinnel liláskék színreakciót ad ami 570 nm-en fotometrálható. A szekunder aminok (prolin, hidroxi-prolin) a ninhidrinnel sárga színű terméket képeznek, ami 440 nm-en mérhető.

46. Aminosavak reakciója ninhidrinnel

47. Ionkizárásos folyadékkromatográfia

48. Gyanta: nagy ioncserélő kapacitású kationcserélő. • Elválasztás alapja: alkoholok, szénhidrátok és szerves savak disszociálatlan formában be diffundálnak a pórusokba – hidrofób kölcsönhatás, H-híd a protonált ioncserélő csoportokkal. • Mozgófázis: 0,01 – 0,001 M kénsav, vagy salétromsav, esetenként 10-20 v/v% acetonitril.

49. GÉLKROMATOGRÁFIA • Szinonim elnevezések: gélszűrés, molekulaszűrés, méretkizárásos kromatog-ráfia, géláthatolási kroma-tográfia. • Egyike a legfontosabb biokémiai eljárásoknak. • Elsősorban biológiai mak-romolekulák tisztítására alkalmazzák. 30 éve alkal-mazott technika. • Fordított szűrő!

50. Gélképző anyagok • Természetes gélképző anyagok Agaróz: D-galaktóz és 3,6-anhidro-L-galaktóz egységekből felépített lineáris poliszacharid. → Sepharose • Félszintetikus gélképző anyagok Dextrán: glükózegységekből 1,6-α-glükozid kötésekkel felépített lineáris poliszacharid, kevés oldallánccal. → Sephadex A nyers dextrán részleges hidrolizsével nyert dextránfrakciók lúgos oldatához epiklórhidrint (CH2-CH-CH2-Cl) adnak. „Végtermék”: O Dextrán-O-CH2-CHOH-CH2-O-dextrán A keresztkötések számával csökken a gélek pórusmérete és annak a molekulaméretnek a határértéke, amely a gél szerkezetébe még éppen behatolhat.