Motilità e Citoscheletro

1. Motilità e Citoscheletro • MOVIMENTI INTRACELLULARI E MOTILITA’ DELLE CELLULE STESSE • Indispensabili per la sopravvivenza di molti organismi • Spermatozoo, globuli bianchi, neuroni • CITOSCHELETRO • Impalcatura interna delle cellule • Supporto alle proteine motrici • Assemblaggio e disassemblaggio delle proteine del CS producono movimento

2. Adesione e Matrice Extracellulare • MOLECOLE DI ADESIONE: • Cell-cell; cell-strutture circostanti • Integrità e comunicazione tissutale • MATRICE: • Supporto, protezione, riserve energetiche, ancoraggio per cell e tessuti

3. CITOSCHELETRO:Sistema di filamenti che svolge funzioni sapaziali e meccaniche nella cellula • organizzazione spaziale delle cellule • forma e movimento • riarrangiamento dei componenti interni durante la crescita e la divisione cellulare • mitosi • traffico intracellulare di organelli e molecole • sostegno alla membrana plasmatica • guida la crescita della parete cellulare vegetale

4. Filamenti di actina (microfilamenti): determinano la forma della superficie cellulare e sono necessari per la locomozione dell’intera cellula (lamellipodi, filipodi) Microtubuli:determinano le posizioni degli organelli e dirigono il trasporto intracellulare (formazione del fuso mitotico, cilgia e flagelli) Filamenti intermedi:forniscono forza meccanica e resistenza agli stress (involucro nucleare, assoni) Proteine accessoriesono essenziali per l’assemblaggio controllato dei filamenti del citoscheletro, comprendono i motori proteici che muovono gli organelli o i filamenti stessi. Strutture dinamiche e adattabili Cambiano o persistono per archi di tempo variabili Composte da diverse subunità macromolecolari Le caratteristiche di tali componenti unitarie conferiscono le proprietà del filamento finale FILAMENTI DEL CITOSCHELETRO

5. Filamenti di Actina • Polimeri elicoidali a 2 filamenti della proteina ACTINA • Strutture flessibili • 5-9nM • Fasci lineari • Reti bidimensionali • Gel tridimensionaliconcentrati soprattutto nella corteccia

6. Microtubuli • Cilindri cavi • Unità: tubulina (alfa e beta) • 25nM • Rigidi • MTOC: centrosoma

7. Filamenti Intermedi • Unità: famiglia eterogenea di proteine • 10nM • Lamina nucleare, assoni, tessuti epiteliali

8. PROTOFILAMENTI • I polimeri del citoscheletro sono costituiti lunghe file di subunità unite per le estremità, che si associano fra loro lateralmente. • Tenute insieme da interazioni idrofobiche e legami non covalenti deboli • Le posizioni e i tipi di contatti sono diversi per i diversi filamenti.

9. Assemblaggio di subunitàin un aggregato iniziale (o nucleo) Stabilizzazione dei contatti subunità-subunità Allungamento del polimero per aggiunta di altre subunità NUCLEAZIONE

10. NUCLEAZIONE • la polimerizzazione dipende dalla concentrazione di subunità non polimeriche • Concentrazione critica: quando il tasso di associazione e dissociazione si equivalgono • Punto stazionario • proteine speciali per catalizzare la nucleazione dei filamenti in siti specifici, determinando la posizione in cui si assemblano nuuovi filamenti del citoscheletro

11. POLARITA’ DEI FILAMENTI DEL CITOSCHELETRO: • il terminale con il tasso di polimerizzazione maggiore è detto terminale (+) (“plus end”); • il terminale con il tasso di polimerizzazione minore è detto terminale (- )(“minus end”); MT: subunità alfa; Actina= estremità ATP

12. I filamenti del citoscheletro possono organizzarsi in strutture di ordine superiore: • I filamenti intermedi formano legami crociati e si associano in fasci molto forti; associazione mediata anche da proteine come la filaggrina (forma fasci di filamenti di cheratina), la plectina (forma fasci di vimentina)… • i filamenti di actina possono organizzarsi con proteine che formano fasci (legami crociatitra filamenti di actina)e proteine che formano gel (tengono insieme due filamenti di actina angolati tra loro)

13. Regolazione della dinamicità del citoscheletro (formazione di fasci, allungamento o accorciamento…) • ATTIVAZIONE DELLE PIASTRINE: • Cellule anucleate • Circolano nel sangue • Formano coaguli nei siti di ferite • Contatto con vaso danneggiato o segnale chimico esterno (ex, trombina) = attivazione • Cascata segnale • Rapido influsso intracell di Ca2+ • Attivazione delle proteine che regolano l’actina (inattivazione delle prot che bloccanono l’allungamento) • Rapido allungamento dei filamenti di actina • Formazione di fasci e reti di actina: lamellipodi e filipodi (inserimento nel sito del coagulo) • Cessazione del segnale di attivazione (- Ca2+): stabilizzazione vs depolarizzazione e allungamento= piastrina bloccata nella nuova forma appiattita • Miosina II: contrazione dei filamenti di actina = avvicinamenti dei bordi della ferita cui la piastrina è adesa

14. Attivazione delle piastrine

15. CONTATTI FOCALI: Tipo altamente specializzato di attacchi tra i filamenti di actina e matrice extracellulare che permette alle cellule di esercitare una trazione sul substrato a cui sono attaccate FIBRE DA STRESS: A livello dei contatti focali, consistono di fasci contrattili di filamenti di actina e di miosinaII che terminano in corrispondenza della membrana plasmaticadove si localizzano gruppi di proteine di adesione transmembrana (integrine).

16. Organizzazione dell’actina nella cellula

17. PROTEINE MOTRICI • Motori molecolari • Si associano alle fibre polarizzate del citoscheletro • Usano l’energia derivata dall’idrolisi dell’ATP per muoversi lungo di esse • Si differenziano per il filamento a cui si attaccano, per la direzione in cui si muovono e per il cargo che portano • Trasporto di componenti subcellulare (organelli, cromosomi…) • Conferiscono forza alla rete dei polimeri: determinano la forma della cell • dopo aver svolto l’azione motoria possono staccarsi dal filamento. • DUE REGIONI: • Testa: dominio motore (idrolisi dell’ATP) • Coda: autoassemblaggio delle prot motrici; associazione al “cargo” • Dà specificità ai diversi tipi di motore • Spostamento del motore sul filamento (quando il filamento è ancorato) o del filamento stesso per mezzo dei motori (quando i motori soni ancorati).

18. Tipi principali di proteine motrici: • Miosina • Chinesina • Dineina

19. Miosina (actina) • Miosine: uniche proteine motrici che si muovono su binari di actina • Diversi tipi di miosina: struttura e localizzazione • Tutti i tipi di miosina si muovono verso l’estremità + di un filamento (differenti velocità) • eccezione: miosina VI • Miosina II: • generazione della forza necessaria alla contrazione muscolare • Prima proteina motrice identificata

20. Miosina II • Proteina allungata formata da 2 catene pesanti (rosso) e 2 copie di 2 tipi di catene leggere (blu). • Catena pesante: dominio di testa globulare all’N-terminale (motore) e una lunga sequenza amminoacidica che forma un coiled-coil -alfa eliche superavvolte- (media la dimerizzazione attrverso). • Catene leggere: si legano vicino alle teste • Sempre associata ad attività contrattile sia in cellule muscolari che non • Citochinesi • Divisione cellulare • Migrazione cellulare

21. Filamenti spessi • Le code possono formare un fascio con altre molecole di miosina (interazioni coda-coda= filamenti spessi bipolari)

22. Generazione della forza motriceIdrolisi ATP= cambio conformazionale • Configurazione rigor • No ATP • La testa di Miosina lega saldamente il filamento di actina • Durata breve (nel muscolo) • Termina con l’attacco di un nucleotide trifosfato • Legame ATP • Cambio conformazionale lievedei domini che compongono il sito di attacco con l’actina • Ridotta affinità actina-miosina • Distacco: il movimento è consentito

23. Generazione della forza motriceIdrolisi ATP= cambio conformazionale • Idrolisi=cambio conformazionale notevole • Spostamento della testa sul filamento di 5nM • ATP e Pi legano sempre la miosina • Nuovo legame actina- miosina • Rilascio del Pi • Colpo di potenza

24. Generazione della forza motriceColpo di potenza • La testa di miosina riguadagne la conformazione iniziale sul filamento di actina • No nucleotide • La miosina lega l’actina in una nuova posizione • Inizio di un nuovo ciclo

25. FIBRE MUSCOLARI • cellule multinucleate • Miofibrilla • Sarcomero • Filamenti sottili: actina • Estremità + = disco Z (estremità del sarcomero) • Estremità - = filamenti spessi • Filamenti spessi: miosina II • Accorciamento del sarcomereo (contrazione): scivolamento delle fibre (non accorciamento delle stesse) • Processo dipendente dalla [Ca2+]

26. Disco Z: all’estremità del sarcomero, sito di attacco per le estremità+ dei filamenti sottili. Linea M: è la posizione di proteine che collegano filamenti adiacenti di miosina fra loro. Banda chiara: filamenti sottili

27. Chinesina (microtubuli) • proteina motrice identificata nell’assone gigante di seppia • composta da 2 catene pesanti e 2 leggere (2 domini motori globulari e un coiled-coil allungato responsabile della dimerizzazione) • Motore N-terminale; movimento in direzione + • KRP • coinvolta nel trasporto anterogrado (trasporto assonale veloce) di molecole (RE), dal corpo cellulare, verso la terminazione dell’assone

28. Ciclo della Chinesina • Chinesina: 50% lega; 50 % non lega il MT durante il ciclo di H-lisi dell’ATP • Attacco dell’ATP alla testa della chinesina che lega il MT spinge in avanti la seconda testa (legata all’ADP) • La seconda testa lega il MT • L’H-lisi dell’ATP su una testa e il distacco del’ADP sull’altra riporta alla conformazione iniziale ma con le teste invertite e con uno spostamento spaziale

29. Miosina vs chinesina • Miosina: • passo singolo ma lungo • Ciclo rapido • Opera come un fascio • Chinesina: • Passi multipli, ma brevi • Ciclo più lento • Opera come unità singola

30. Dineine (microtubuli) • composte da 2 o 3 catene pesanti (comprendono il dominio motore) e un numero grande e variabile di catene leggere associate • si muovono verso l’estremità (-) dei microtubuli • coinvolte nel trsaporto retrogrado di molecole (Golgi) o organelli racchiusi in vescicole dalla terminazione, verso il corpo cellulare del neurone • DINEINE CITOPLASMATICHE: omodimeri di catene pesanti con 2 grandi domini motori come teste • DINEINE ASSONEMALI: eterodimeri ed eterotrimeri con 2 o 3 domini di testa; coinvolte nello spostamento veloce di microtubuli nelle ciglia

31. MODELLO PER L’ATTACCO DI DINEINA AD UN ORGANELLO La dineina richiede l’associazione con dinactina (complesso proteicoche comprende un filamento simile all’actina che interagisce con complessi proteici presenti sulle membrane degli organelli) per svolgere la sua funzione REGOLAZIONE: fosforilazione, cAMP….

32. CIGLIA E FLAGELLI: • Sono strutture mobili costituite da microtubuli e dineine • strutture mobili altamente specializzate ed efficienti • appendici cellulari con un fascio di microtubuli centrale FLAGELLI: • Su spermatozoi e in molti protozoi • movimento ondulatorio permette alle cellule di nuotare in mezzi liquidi CIGLIA: • più corte dei flagelli ma organizzate in modo simile • movimento a frusta • cicli di ciglia adiacenti sono sincronizzati ma non esattamente (movimento ad onda) • muovono singole cellule in un fluido o muovono un fluido sulla superficie di un gruppo di cellule in un tessuto (vd. Apparato respiratorio)

33. Movimento di ciglia e flagelli: Forza perpendicolare all’asse dell’assonema Disposizione dei MT a “9+2” nell’assonema di ciglia e flagelli

35. CORPI BASALI: strutture che radicano ciglia e flagelli alla Superficie cellulare. Composti da 9 gruppi di triplette di Microtubuli fusi • FLAGELLI BATTERICI: • Flagellina • Rotazione ad elica

36. MOVIMENTO CELLULARE: POLARIZZAZIONE DI CELLULE DI LIEVITO:coinvolge l’ACTINA durante la gemmazione e i MICROTUBULI nella polarizzazione morfologica (risposta a fattori di accoppiamento)

37. CELLULE CHE STRISCIANO SU UN SUBSTRATO SOLIDO :processo integrato e complesso che dipende dalla corteccia cellulare ricca di actina; coinvolte 3 attività. PROTRUSIONE Filipodi: 1D Lemellipodi: 2D Pseudopodi: 3D ATTACCO: TRAZIONE: • Sviluppo, embriogenesi, neuroni • Animale adulto, risp immunitaria, osteoblasti, fibroblast (connettivo) • Patologie, tumori

38. Lamellipodi e increspature Fibroblasti in coltura su un foglio di gomma al silicone

39. Organizzazione dei microtubuli in fibroblasti e neuroni

40. Cono di crescita dei neuroni

41. MATRICE EXTRACELLULARE • insieme di proteine e polisaccaridi, secrete da diversi tipi di cellule, che costituiscono strutture extracellulari in grado di svolgere diverse funzioni • diversa concentrazione delle diverse componenti della matrice dà origine a strutture molto diverse tra loro (es, tendini, cartilagini dell’osso…) • funzione principale di sostegno • altre funzioni di regolazione della divisione cellulare, adesione, motilità e migrazione cellulare (distruzione controllata della matrice ad opera di proteasi), differenziamento durante l’embriogenesi • le funzioni diverse dipendono dalle sostanze che la compongono e dalla loro particolare disposizione

42. Le cellule che producono le molecole della matrice sono essenzialmente fibroblasti ; In certi tipi specializzati di tessuti connettivi (cartilagine e osso) tali molecole sono secrete da cellule della famiglia dei fibroblasti più specializzate (es, condroblasti e osteoblasti)

43. Due classi principali di macromolecole extracellulari compongono la matrice extracellulare: - catene polisaccaridiche della classe chiamata glicosamminoglicani (GAG), che si trovano di solito uniti covalentemente a proteine sotto forma di proteoglicani - proteine fibrose, fra cui collagene, elastina, fibronectina e laminina che hanno funzioni sia strutturali che adesive. Le molecole di proteoglicano nel tessuto connettivo formano una “sostanza basale” simile a gel altamente idratata in cui le proteine fibrose sono immerse. Le fibre di collagene rafforzano e aiutano ad organizzare la matrice e fibre di elastina simili a gomma le danno elasticità.

44. GLICOSAMMINOGLICANI: Sono catene polisaccaridiche non ramificate composte da unità ripetute di disaccaridi. Uno degli zuccheri è sempre uno zucchero amminico (nella maggior parte dei casi è solfato). Il secondo zucchero è di solito un acido uronico (glucuronico o iduronico)

45. PROTEOGLICANI: Sono prodotti dalla maggior parte delle cellule animali. La catena polipeptidica, o nucleo proteico, è prodotta dai ribosomi del RER e introdotta nel lume. Le catene polisaccaridiche sono assemblate su questo nucleo principalmente nell’apparato del Golgi. Qui vengono anche aggiunti gli zuccheri.

46. COLLAGENI: Famiglia di proteine fibrose secrete da cellule del tessuto connettivo e da una varietà di altri tipi cellulari. Sono le proteine più abbondanti nei mammiferi (costituiscono pelle ed osso). Danno origine a fibre semicristalline che tengono in posizione le cellule, conferiscono resistenza alla tensione ed elasticità alla matrice; svolgono funzioni importanti nell’ambito della mobilità e dello sviluppo delle cellule. Glicoproteine per lo più insolubili, caratterizzate da un contenuto elevato di Gly e di 2 aa modificati: idrossi-Lys e idrossi-Pro.

47. Singole molecole di collagene sono strutture lineari costituite da 3 catene polipeptidiche. Le singole catene, dette catene a, si avvolgono a formare un’elica sinistrorsa a passo lungo. I residui di Pro, a spaziatura regolare, sono importanti per la stabilizzazione di questa struttura elicoidale. 3 catene a si associano tra loro a formare una tripla elica destrorsa, relativamente rigida; tale struttura è possibile grazie all spaziatura regolare dei residui di Gly (stanno nell’asse centrale). La tripla elica è responsabile della natura fibrosa . A seconda del tipo di collagene, la tripla elica può essere continua, o può contenere regioni che danno origine a strutture a conformazione meno ordinata. Questi elementi fungono da regioni cardine e danno maggiore flessibilità.

48. FIBRE ELASTICHE: • Rete nella matrice, possono tenere insieme fibre di collagene. Componente principale è l’ELASTINA (proteina altamente idrofobica, ricca di Pro e Gly, non glicosilata). L’elastina è prodotta a partire da un precursore (TROPOELASTINA) solubile secreto nello spazio extracellulare ed è assemblata in fibre vicino alla membrana plasmatica. Segue la formazione di legami crociati che permette la formazione di una rete.

49. FIBRONETTINA: • Grossa glicoproteina, dimero composto da 2 subunità molto grandi unite da legami disolfuro ad una estremità. Ciascuna subunità è ripiegata in una serie di domini funzionali distinti separati da regioni di catena polipeptidica flessibile. Può dare fibrille.

50. LAMINE BASALI: • Sottili tappeti flessibili di matrice specializzata, sottostanti ai fogli e tubi di cellule epiteliali. Funzione di separazione e filtro (glomerulo); determinano la polarità cellulare , influenzano il metabolismo. Sintetizzata in gran parte dalle cellule che si trovano su di essa; fibrille di ancoraggio composte soprattutto da collagene di tipo IV. Ruolo ISTRUTTIVO nella rigenerazione (giunzione neuromuscolare).