Cromatografia

1. Cromatografia Fabrizio Papa

2. Simulazione di una Cromatografia

3. Poniamoci alcune domande: • Perché da una sostanza verde abbiamo ottenuto due sostanze, una gialla ed una blu? 2) Perché le due sostanze sono scese verso il basso? 3) Perché le due sostanze si sono separate? 4) Perché il volume occupato dalle sostanze è aumentato? 5) Perché la sostanza blu più trattenuta occupa un volume maggiore della sostanza gialla meno trattenuta?

4. Un esempio

5. Cerchiamo ora di individuare gli elementi della simulazione cromatografica e dell’esempio dei tipi chiacchierone e riservato ed abbinarli tra loro. Tubo di vetro TipoVioletto riservato Sostanza gialla Corso Folla Solido Gambe Tipo rosa chiacchierone Solvente Esempio Simulazione Sostanza blu

6. Cerchiamo ora di rispondere ad una domanda più difficile: Perché le bande si allargano? Per rispondere a ciò riprendiamo ancora l’esempio dei tipi chiaccherone e riservato.

7. Perché si allarga la banda? Un esempio. 1 1 2 2 3

8. Intensità 3 2 1 Tempo Cromatogramma

9. Non resta che cercare dei termini più appropriati per identificare gli elementi e gli eventi osservati e avremo definito tutto sulla cromatografia. Colonna cromatografica Tubo di vetro Fase stazionaria Solido Eluente: fase mobile Solvente Eluizione Trascinamento del solvente Soluti Sostanze

10. Intensità Tempi di ritenzione t R = tempo di ritenzione t’ R tempo di ritenzione corretto K’ = (tR – t0)/t0 Kd = Cs/Cm Fattore di capacità Coefficiente di distribuzione K’ = Kd*Vs/Vm t0 Tempi

11. Analizziamo ora l’ampiezza della banda: W1/2 H1/2 W Intensità t R = tempo di ritenzione H Tempo

12. Analizziamo ora in maniera più scientifica perché la banda si allarga: Percorsi multipli

13. Diffusione longitudinale

14. In fase stazionaria In fase mobile stagnante Fase mobile Fase stazionaria Trasferimenti di massa

15. Diamo dei valore ai tre contributi che influiscono sull’allargamento della banda A Percorsi multipli = B Diffusione longitudinale = Trasferimento di massa = O raggiungimento dell’equilibrio C

16. HETP = A + B/v + C*v v = flusso Equazione di Van Deemter HETP = altezza del piatto teorico lunghezza della colonna = L n = L / HETP n = numero dei piatti teorici

17. 3 + 4 + 5 + 6 + 7 Media = = 5 5 Un po’ di statistica Esempio: Una fabbrica produce dei prodotti (compresse) con 5 mg di principio attivo (caffeina) Vi chiedono di verificare se le compresse prodotte contengono effettivamente 5 mg di caffeina ed in caso contrario di valutare la variabilità. E voi cosa fate? 1) Le analizzate tutte? 2) Ne prelevate un po’ in modo casuale e le analizzate? Ne preleviamo 5 che danno il peso di 3, 4, 5, 6, 7

18. La media non ci dice nulla sulla variabilità Proviamo con gli scarti dalla media 3 – 5 = -2 3 – 5 = -2 3 – 5 = (-2)2 4 – 5 = -1 4 – 5 = -1 4 – 5 = (-1)2 Eleviamo al quadrato 5 – 5 = 0 5 – 5 = 0 5 – 5 = (0)2 6 – 5 = 1 6 – 5 = 1 6 – 5 = (1)2 7 – 5 = 2 7 – 5 = 2 7 – 5 = (2)2 somma 0 0 somma 10 Quello che abbiamo ottenuto si chiama Devianza

19. 10 = 2,5 5 - 1 Dividendo per il numero dei campioni o osservazioni o meglio per i gradi di libertà ci avviciniamo alla variabilità del singolo campione Abbiamo appena ottenuto la Varianza

20. 2,5 = 1,58 Avendo prima elevato al quadrato ora possiamo fare l’operazione inversa con la radice quadrata Abbiamo finalmente ottenuto la Deviazione Standard

21. La deviazione standard in una curva di Gauss è cade nel punto di flesso Riprendiamo i numeri appena analizzati 3, 4, 5, 6, 7 Un campionamento di cinque non è molto serio Facciamo un campionamento di 100 numeri approssimando i pesi a 0,5 Grafichiamo i dati su un istogramma Distribuzione di Gauss La somma delle osservazioni tra –s e +s risulta essere il 68,2%

22. Ancora un piccolo esempio: Due ditte producono due diversi prodotti: 1) Ha una media di 10 e s 2 2) Ha una media di 100 e s 2 Ci chiediamo qual è la ditta che lavora meglio, ovvero è più precisa, ovvero richiamando un termine cromatografico è più efficiente? La deviazione standard è uguale Proviamo a rapportare la deviazione standard alla media 2/10 = 0,2 Se moltiplichiamo per 100 otterremo 20 e 2 ovvero il Coefficiente di Variazione Percentuale o CV% 2/100 = 0,02 Questo ci dice chiaramente che la ditta che lavora meglio è la seconda

23. s/ tR I valori di questo rapporto sono molto piccoli, prendiamo il reciproco tR/s O ancora meglio il suo quadrato (tR/s)2 N = (tR/s)2 1 deviazione standard equivale ad un’ampiezza di picco misurata a 0,882 di altezza, non facile da prendere e quindi si misura alla base che equivale a 4 deviazioni standard o a metà altezza che corrisponde a 2,354 s N = 16(tR/Wb)2 N =(tR/Wb/4)2 N =(tR/h1/2/2,354)2 N = 5,545(tR/h1/2)2

25. Equilibrio? Kd = Cs/Cm Kd = [fenolo]s/[fenolo]m Solvente = etile acetato Solido = silice Soluto = fenolo

26. Estrazione con imbuto separatore, un processo all’equilibrio Kd = Cm/Cs Kd = [fenolo]H2O/[fenolo]CH2Cl2

27. HPTE C B A v = flusso La cromatografia non è un processo all’equilibrio Proviamo a riportare su grafico i tre contributi che tendono ad allargare una banda cromatografica

28. La cromatografia ci permette di separare due o più sostanze Abbondanza Risoluzione tR

29. Ancora sulla risoluzione Cattiva risoluzione Buona risoluzione dovuta all’efficienza della colonna Buona risoluzione dovuta alla selettività della colonna

30. Risoluzione t r1 t r2 Dt R = 2 Dt/(W2 + W1) W1 W2

31. Efficienza Particelle di silice Bande lungo la colonna Cromatogrammi

32. Fase mobile A B Fase stazionaria Selettività Cambiando la fase stazionaria Cambiando la fase mobile Kd = Cs / Cm K’ = tR – t0 / t0 KdA Soluto A KdB Soluto B Cambiano i tempi di ritenzione

33. Parliamo di tipi diversi di cromatografia Classificazione in base alla fase mobile Cromatografia su strato sottile in colonna, HPLC Liquida Gassosa Gascromatografia in colonna Tra la cromatografia liquida e la gascromatografia, in colonna A fluido supercritico

35. Siti attivi Cromatografia di assorbimento Fase mobile Fase stazionaria (solido)

36. Un esempio di cromatografia di adsorbimento (fase inversa) Silice (Solido) Paradifenolo Ortodifenolo Cicloesano Etileacetato

37. Supporto solido Cromatografia di ripartizione Fase mobile Fase stazionaria (liquida)

38. Un esempio di cromatografia di ripartizione (fase inversa) Silice (solido) Fase stazionaria Catene C18 (liquido) Aldeide C7 Fase mobile 80% 40% 60% 20%

39. Altre fasi stazionarie Cianoalchil Amminoalchil Fenilalchil Nitroalchil

40. Cromatografia di esclusione

41. - + - + - + + + + + + + + + + + Cromatografia di scambio ionico

42. Gruppi scambiatori di ioni Gruppo trimetilammonio Gruppo solfonato Scambiatore di anioni Scambiatore di cationi

43. Cromatografia di affinità

44. Perché eseguire un’analisi cromatografica? Analisi qualitativa Indicazioni per identificare una sostanza Analisi quantitativa Quantificazione della sostanza

45. tR tR Analisi qualitativa In generale sostanze diverse hanno tempi di ritenzione diversi

46. h h Linea di base Linee di base corrette(da valle a valle) Analisi Quantitativa

47. S = Base * Altezza/2

48. Totale = 1 + 2+ 3+ 2+ 1 = 9 Integrazione

49. A B C Normalizzazione interna ST = SA+SB+SC Il rivelatore risponde allo stesso modo con i vari componenti %C = Sc/ST*100 %B = SB/ST*100 %A = SA/ST*100

50. A B C Ancora normalizzazione interna Il rivelatore non risponde allo stesso modo con i vari componenti SA*fA/CA = SBfB/CB = SC*fC/CC fA = 1 fB = SA/CA*CB/SB fC = SA/CA*Cc/Sc S’B = SB * fB S’C = SC * fC S’A = SA * fA Stot = S’A + S’B + S’C CA= SA/STot CB= SB/STot CC= Sc/STot