Avances moleculares aplicados a la cl ínica

1. Avances moleculares aplicados a la clínica Dr. Denis Landaverde Recinos Oncólogo Médico Msc. Genética y Biología Molecular

2. Métodos Diagnóstico Moleculares • PCR • RT-QPCR • FISH • Microarreglos • Bioinformática

3. Dogma Central de la Biología Molecular

4. T A C A T C G A T C G A U G U A G C U A G C ADN ARN Transcripción

5. A U G U A G C U A G C U A C A U C ARNt 1 2 transfer Ile T A C A T C G A T C G ADN Ribosoma mensajero ARNm Met Traducción

6. A U C G A U 2 3 Asp T A C A T C G A T C G ADN A U G U A G C U A G C ARNm ARNt Met Ile

7. Met Ile Asp T A C A T C G A T C G ADN A U G U A G C U A G C ARNm Proteína

8. T A C A T C G A T C G ADN A U G C A C ARNm G U U G Degradación A Juang RH (2004) BCbasics

9. Versión final del mecanismo genético celular ADN ARNm 5’ proceso 3’ ribosoma ARNm maduro ARNm cap 5’ 3’ cola proteinas proteinas ADN es reemplazado por el ARN volviéndose el principal material genético ARN permite la biosíntesis protéica ADN Procariota Eucariota Juang RH (2004) BCbasics

10. PCR

11. DNA PCR Muchas moleculas amplificación (molecule sencilla) Reacción en cadena de la polimerasa - PCR PCR es básicamente una técnica de amplificación del DNA.

12. Reacción en cadena de la polimerasa - PCR • Síntesis por DNA polimerasa • -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G Cortos primers de DNA específicos hibridizan con la cadena que tiene que ser copiada

13. Reacción en cadena de la polimerasa - PCR • Síntesis por DNA polimerasa • -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T

14. Reacción en cadena de la polimerasa - PCR • Síntesis por DNA polimerasa • -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A

15. Reacción en cadena de la polimerasa - PCR • Síntesis por DNA polimerasa • -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C

16. Reacción en cadena de la polimerasa - PCR • Síntesis por DNA polimerasa • -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C G

17. Reacción en cadena de la polimerasa - PCR • Síntesis por DNA polimerasa • -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C G T

18. Reacción en cadena de la polimerasa - PCR • Síntesis por DNA polimerasa • -A T G C A T G C A T G C * * 5’ 3’ -T A C G T A C G T A

19. Primer 1 Extensión de la cadena Cadena original de DNA Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Despues del primer periodo de sintesis de DNA, tenemos copiada una cadena de DNA ¿Cómo produce este proceso una AMPLIFICACIÓN?

20. Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (~100°C)

21. Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (~100°C)

22. 2 1 Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Primero, la fusión separa las dos cadenas de DNA a alta temperatura (~100°C) Luego, usando un segundo primer, se copia la nueva cadena con la DNA polimerasa Al mismo tiempo, la cadena original se copia nuevamente, dado que hay un rexceso de Primer 1 Ahora tenemos dos copias de la molécula original

23. Hibridización 50-60ºC Extensión de La cadena 75ºC Fusión 95°C 2do Ciclo 95ºC 50 - 60ºC 75ºC Primer Ciclo Reacción en cadena de la polimerasa - PCR Para controlar el proceso, necesitamos controlar la temperatura Si repetimos el ciclo, tendremos cuatro copias Múltiples ciclos darán un incremento exponencial en el número de copias

24. Hay 7 componentes esenciales en el proceso standard de PCR • ADN polimerasa termoestable • Oligonucleotidos iniciadores (“primers”) • Desoxiribonucleótidos trifosfatados (dNTPs) • Cationes divalentes • Buffer (para mantener el pH) • Cationes divalentes • ADN molde (Templado)

25. RT-QPCR

26. Intrones y Exones en Células Eucariotas exon exon exon intron intron 5’ 3’ 5’ 3’ ADN promotor Codón terminacion Codón inicio Transcripción ARNm Procesado cap Cola Poly A Empalme Intron Borrado ARNmaduro Al citoplasma En el núcleo Juang RH (2004) BCbasics

27. El ADNc es transcrito en forma reversa del ARNm 5’ 3’ 3’ 5’ 5’ ARNm maduro Cola poly A Retro Transcripción TTTT 3’ 5’ ARN hidrolisis ADN Polimerasa 3’ CCC 5’ GGG 3’

28. RT-PCR = PCR con transcriptasa reversa • Para amplificar copias de cDNA de RNA • Es especialmente útil cuando solo se dispone de pequeñas cantidades de RNA • Frecuentemente usada para amplificar genes específicos (como cDNAs) si algo de su secuencia es conocida • Requiere primer “antisense” y un DNA polimerasa dependendinte de RNA • Puede ser usada para construir bibliotecas de cDNA

29. mRNA (sense) Primer Antisense: oligo(dT)o AAAAAAAAAA-3’ TTTTTTTTTT-5’ Transcripción reversa GSP1 (sense) AAAAAAAAAA-3’ TTTTTTTTTT-5’ 1ra cadena cDNA GSP (antisense) PCR usando GSP+GSP1 GSP1 GSP RT-PCR Requiere el conocimiento de la secuencia para diseñar GSP and GSP1

30. Fluorescence in situ Hybridization

31. Fluorescence in situ Hybridization (FISH) • FISH – es un proceso en el cual se pintan las cromosomas o porciones de los mismos con moléculas flourescentes

32. Fluorescence in situ Hybridization (FISH) • Identifica anormalidades cromosómicas. • Ayuda para el análisis de aberraciones estructurales, determinación de ploidías, mapeo de genes, etc.

33. Fluorescence in situ Hybridization (FISH) • Usado para identificar la presencia y localización de una resión de AND o ARN con preservación morfológica de preparados de cromosomas en células fijadas o secciones de tejido.

34. FISH Procedimiento • Desnaturalizar los cromosomas • Hibridación • Marcado Flourescente • Examinar las láminas en la oscuridad.

35. FISH Procedimiento

36. Microarreglos

37. Los Microarrays • Son dispositivos miniaturizados capaces de realizar un experimento de hibridación múltiple. • En la actualidad, existen microarrays que contienen secuencias de todos los genes de un organismo. • Se emplean para estudiar si existen genes comunes entre muestras, o sobre todo, para estudiar la expresión de genes globalmente. • A continuación, veremos una imagen de un microarray.

38. Tamaño de un Microarray • Un microarray contiene miles de puntos, cada uno correspondiente a una secuencia específica para un gen, compuesta de unos 25 nucleótidos. • Sin embargo, el tamaño del dispositivo entero es el mismo que el de un portaobjetos normal.

39. Biochip Basado en Hibridizacion Muestra de ADN ADN complementario hibridizado Biochip Cada mancha contiene ADN conocido Señal aparente Schena (2000) Microarray Biochip Technology, p. A31

40. A microarray analysis machine

41. An example of red, green and yellow spots.

42. Bioinformática

43. BioinformáticaDefinición intuitiva Conjunto de herramientas informáticas que sugieren soluciones a problemas biológicos

44. Bioinformática es la aplicación de los ordenadores y los métodos informáticos en el análisis de datos experimentales y simulación de los sistemas biológicos

46. Una definición mucho más global es: • Bioinformática es la aplicación del desarrollo de la computación y las matemáticas que permite la administración, análisis y comprensión de datos para resolver preguntas biológicas. (con conexiones a medi-, quimio-, neuro-, etc. informática). Modificado de: Center for Research on Innovation and Competition (Harvey & Mc. Meekin, 2002).

47. Bases de datos • Existen bases de datos primarias, que contienen información directa de la secuencia, estructura o patrón de expresión de ADN o proteína, y secundarias, que contienen datos e hipótesis derivados del análisis de las bases de datos primarias, como mutaciones, relaciones evolutivas, agrupación por familias o funciones, implicación en enfermedades, etc.

48. De nucleótidos • La colaboración de las tres bases de datos más importantes hace posible acceder a casi toda la información de secuencias de ADN desde cualquiera de sus tres sedes: • EMBL-BANK en el Instituto europeo de Bioinformática (EBI) • Enlace externo: EMBL-BANK • DNA Data Bank of Japan (DDBJ) en el Centro de Información Biológica (CIB) • Enlace externo: DDBJ • GenBank en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) • Enlace externo: GenBank Entrez Nucleotide • Si bien son mantenidas por distintos organismos en distintos paises, existe una coordinación entre las distintas bases. Una secuencia enviada a cualquiera de las bases se verá reflejada en las otras dos en aproximadamente una semana, ya que esa es la frecuencia de actualización entre las distintas bases genéticas. Por este motivo es indistinto que base se use para enviar nuevas secuencias, aunque normalmente los europeos utilizan EMBL-BANK y los americanos GenBank.

49. De proteínas • Bases de datos de secuencias de aminoácidos. • Swissprot contiene secuencias anotadas o comentadas, es decir, cada secuencia ha sido revisada, documentada y enlazada a otras bases de datos. • Enlace externo: Swissprot en el EBI, Swissprot en Expasy • TrEMBL por Translation of EMBL Nucleotide Sequence Database incluye la traducción de todas las secuencias codificantes derivadas del (EMBL-BANK) y que todavía no han podido ser anotadas en Swissprot. • Enlace externo: TrEMBL • PIR por Protein Information Resource está dividida en cuatro sub-bases que tienen un nivel de anotación decreciente. • Enlace externo: PIR • ENZYME enlaza la clasificación de actividades enyimáticas completa a las secuencias de Swissprot. • Enlace externo: ENZYME • PROSITE contiene información sobre la estructura secundaria de proteínas, familias, dominios, etc. • Enlace externo: PROSITE • INTERPRO integra la información de diversas bases de datos de estructura secundaria como PROSITE, proporcionando enlaces a otras bases de datos e información más extensa. • Enlace externo: INTERPRO • PDB por Protein Data Bank es la base de datos de estructura terciaria 3-D de proteínas que han sido cristalizadas. • Enlace externo: PDB

50. ADA COX-2 FKBP XO