1 / 41

ELVÁLASZTÁSTECHNIKA IV.

ELVÁLASZTÁSTECHNIKA IV. HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA Dr. Kremmer Tibor EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest. HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA HYDROPHOBIC INTERACTION CHROMATOGRAPHY (HIC). TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS.

kami
Download Presentation

ELVÁLASZTÁSTECHNIKA IV.

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. ELVÁLASZTÁSTECHNIKA IV. HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA Dr. Kremmer Tibor EÖTVÖS LORÁND TUDOMÁNY EGYETEM Budapest

  2. HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIAHYDROPHOBIC INTERACTIONCHROMATOGRAPHY(HIC)

  3. TÖRTÉNETI ÁTTEKINTÉS • 1971 Affinitási kromatográfiás tölteteknél spacer alkalmazásakor zavaró másodlagos kölcsönhatásokat figyelnek meg • 1972  Shaltiel Hydrophobic Chromatography • Spacer-ligandumként, agaróz hordozóra alkilaminokat alkalmaz • 1973 Hjerten Hydrophobic Interaction Chromatography • PorathHydrophobic Salting-out Chromatography • Kozmotróp sók adagolásával a fehérjék retenciója nő • Hoftsee Hydrophobic Adsorption Chromatography • A ligandum szénláncának növelése és sűrűségének csökkentése növeli az eljárás felbontóképességét • 1976 MorrisHIC (Trends Biochem Sci.) • 1980 - HPLC töltetek • 5-10 m szemcseméret (analitikai) • 20-40 m szemcseméret (preparatív), pórusméret növelése (300Å) • 1986 Nem porózus töltetek (1-3 um) • Perfúziós töltetek (200 és 300-500 nm pórus)

  4. HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA (HIC) matrix spacer protein ligandum (domain)

  5. HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIA (HIC) KÜLÖNBÖZŐ LIGANDUMOK HATÁSA A RETENCIÓRA (Gooding et al. 1984) OH-Propil → Propil → Benzil → i-Propil → Fenil → Pentil  a retenció növekedése 

  6. KÜLÖNBÖZŐ ANIONOK ÉS KATIONOK HATÁSA A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSRA PO43- ~ SO42- ~ CH3COO- ~ Cl- ~ Br- ~ NO3- ~ CIO4- ~ SCN- növekvő besózó - csökkenő kisózó hatás • növekvő kaotrop - csökkenő kozmotrop hatás • NH4+ ~ Rb+ ~ K+ ~ Na+ ~ Cs+ ~ Li+ ~ Mg2+ ~ Ca2+ ~ Ba2+ • Phenyl-Superose, Pharmacia, Uppsala

  7. HUMÁN SZÉRUM SAVANYÚ ALFA-1-GLIKOPROTEIN (AGP) ÉS ALFA-1-ANTITRIPSZIN (AAT) ELVÁLASZTÁSA ÉS TISZTÍTÁSA HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIÁVAL Fractogel EMD Propyl oszlop (10x1 cm, 20-40 m) Eluens A – 20 mM Na-foszfát, pH : 7,2 1,1 M NH4-szulfát Eluens B - 20 mM Na-foszfát, pH : 7,2 Lineáris gradiens elúció Áramlási sebesség : 1 mL/perc Detektálás : 278 nm (Oláh, Kremmer, Boldizsár, J. Chromatogr. 2000) (NH4)2SO4 1,5 M

  8. REFERENCIA FEHÉRJÉK ELVÁLASZTÁSA HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ FOLYADÉKKROMATOGRÁFIÁVAL M (NH4)2SO4

  9. HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA FEHÉRJÉK OVALBUMINRA VONATKOZTATOTT RELATIV RETENCIÓK

  10. Hydrophobic Interaction Chromatography of Proteins Column A: Progel-TSK Butyl-NPR, 3.5cm x 4.6mm ID, 2.5μm particles Column B: Progel-TSK Phenyl-SPW, 7.5cm x 7.5mm ID, 10 μm particles Column C: ProgeI-TSK Ether-5PW, 7.5cm x 7.5mm ID, 10 μm particles Mobile Phase: A - 0.1M phosphate buffer, pH 7.0 and 2.3 → 0M ammonium sulfate (12 min) B - C = 0,1M phosphate buffer, pH 7.0 and 1.8 → 0M ammonium sulfate (60 min) Flow rate: 1mL/min; Temp.: 250 C; Detection: UV 280 nm • Samples: 1.  Myoglobin, 2. Ribonuclesae, 3. Lysozyme, 4. -Chymotrypsin, 5.   -Chymotrypsinogen

  11. A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA ALAPJAI A FEHÉRJÉK SZORPCIÓJA ÉS RETENCIÓJA II. SÓK HATÁSA A FEHÉRJÉK OLDÓDÁSÁRA • 1 - Kis sókoncentrációk • - ionos kölcsönhatások • - stabilizálás • 2 - Nagy sókoncentrációk • - speciális kölcsönhatások, kozmotróp sópárok, • pl. (NH4)2SO4 • - stabilizálás, majd kicsapódás, •  hidrofób kölcsönhatások

  12. HIC - TERVEZÉS

  13. A HIDROFÓB KÜLCSÖNHATÁSÚ (HIC) ÉS FORDÍTOTT FÁZISÚ KROMATOGRÁFIA (RPC) ÖSSZEHASONLÍTÁSA Mindkét technikában közös és jellemző: - Az álló fázis a hordozóra kötött apoláris ligandum. - A szorpció oka a hidrofób (apolárIs) kölcsönhatás. - A retenciót döntő módon a hidrofóbicitási viszonyok határozzák meg. - Mindkét technika alkalmas a fehérjék elválasztására.

  14. A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ (HIC) ÉS A FORDÍTOTT FÁZISÚ KROMATOGRÁFIA (RPC) KÜLÖNBSÉGEI • - A HIC liganduma gyengébben apoláris, kisebb a felületi koncentrációja. • A HIC esetén sokkal gyengébb a szorpció, a fehérje natív formában (folded) marad, kisebb a denaturáció esélye. • A RPC esetében az erős szorpció megszüntetheti az eredeti struktúrát (unfolding), itt a retenciót elsősorban az elsődleges szerkezet hidrofób jellege határozza meg. • - A RPC esetében a fehérje spontán kötődik a ligandumhoz. Az elúciót szerves oldószer adagolása okozza. A HIC esetében a fehérje kötődése a tölteten és a retenció mértéke a kozmotróp só adagolásával érhető el. Az elúció a só negatív koncentráció gradiensének eredménye. • A RPC esetében a hidrofób kölcsönhatásért döntően az álló fázis (ligandum) felelős, • a HIC esetében az áramló fázis (eluens) a domináns tényező

  15. A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA ALAPJAI A FEHÉRJÉK SZORPCIÓJA ÉS RETENCIÓJA I. FEHÉRJÉK "VIZES" KÖZEGBEN • A fehérjék fiziológiás körülmények (pH, ionerősség) között harmadlagos ill. negyedleges szerkezettel (folded) rendelkeznek. • A fehérjék apoláros karakterű aminosav összetevői (Ala, Val, Leu, Tyr, Trp, Phe) a szerkezet belsejébe törekszenek, egy részük azonban a felületre kényszerül (hydrophobic patch). Ez kb. a felület 40%-át képezi, és fontos funkcionális szerepe van a fehérje biológiai aktivitásában. • Frank és Evans (1945) feltételezték, hogy vizes oldatokban a víz molekulái un. "icebergs" formában fedik a hidrofób felületeket. • Némethy és Sheraga (1962) szerint két hidrofób anyag vizes oldatban létrejövő kapcsolata során a víz jégszerű struktúrája mintegy feloldódik és dezorganizálódik (entrópia nő – az energia felszabadulás fedezi az asszociáció energiaigényét) • Vizes oldatokban ezek az erők stabilizálják a fehérjék natív szerkezetét. • A fehérjék a vizes (fiziológiás) közegben általában jól oldódnak (stabilak) és • nem törekszenek hidrofób kapcsolatokra.

  16. A HIDROFÓB KÖLCSÖNHATÁSÚ KROMATOGRÁFIA ALAPJAI A FEHÉRJÉK SZORPCIÓJA ÉS RETENCIÓJA III. SÓK HATÁSA A FEHÉRJÉK OLDÓDÁSÁRA • Melander és Horváth (1977)SZOLVOFÓB ELMÉLET • - Az oldódás során az oldószer az oldandó anyagot befogadó üreget (cavity) • képez. • - Az oldhatóság a határfelületi szabadenergia megváltozásának a függvénye, ami • az oldószer felületi feszültségétől függ. • - Az oldat só koncentrációjának (m) növelésével az oldat felületi feszültsége • arányosan változik: • V = Vo + c . R . m R - a víz felületi feszültsége • c - a só moláris felületi feszültség inkrementuma • - c korrelációba hozható a sók (anionok) liotróp sorával (Hofmeister l888). • - Az elmélet a hidrofób kromatográfiás gyakorlat számára legegyszerűbb formájában a retenció kifejezésére alkalmas össszefüggést (lnk - m) ad. • A kapacitási faktor logaritmusa (lnk) a következő egyenlettel fejezhető ki : • ln k = ln kviz + S. m • az egyenes tengelymetszete (elvileg) a tiszta vízben mérhető kapacitási faktor • logaritmusa. • - A konkrét mérések az elmélet számos bizonytalanságára hívják fel a figyelmet.

  17. PREFERENTIAL INTERACTION ELMÉLET Timasheff (1959) Arakawa és Timasheff (1982) -  Egy egyensúlyi rendszerben lévő oldathoz adott komponens megváltoztatja a fennálló egyensúlyt. -  Az új komponens nem egyforma mértékben lép kölcsönhatásba a már ott lévő komponensekkel (preferentíal interaction), ezt fejezi ki a preferential interaction paraméter (PIP). -  Mérése a szabadentalpia vagyis a kémiai potenciál változásának mérésével lehetséges, ez arányos a felületi feszültség változással. -  Megállapították, hogy a kisózószerek (kozmotróp sók) a fehérjék környezetében negatív PIP értékkel bírnak, vagyis kizáródnak a fehérjék közeléből. Ennek eredménye egy többlet hidratáció, amely a fehérje kémiai potenciálját megnöveli végezetül kicsapódáshoz vezet. -  A só-fehérje kölcsönhatás két ellentétes hatás eredője: 1. kedvezőtlen felületi feszültség változás 2. kedvező só kötődés A kisózó szerek esetében az első hatás a domináns (egyértékű kationok sói), a besózó szerek esetében a második kompenzálja az elsőt.

  18. A ligandum szerkezetének szerepe az albumin kötödésében a hidrofób kölcsönhatású kromatográfiában

  19. AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA AFFINITY CHROMATOGRAPHY (AFF)

  20. AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA • ALAPELV • Kovalens kötéssel (általában köztes láncon keresztül - spacer, leash, tentacle) hordozó szemcsékre (mátrix) rögzített • különböző funkcionális csoportok (ligandum), amelyek • Az elválasztandó (bio)molekulával specifikus és reverzibiliskölcsönhatásokat képeznek. • Mátrix: • - Poliszacharidok: agaróz                     (Sepharose, Superose) • cellulóz • - Organikus polimerek: • poliakrilamid • hidroxialkil metakrilát (Spheron) • etilénglikol metakrilát (Fractogel) • - kevert agaróz-poliakrilamid        (Ultrogel) • - Silica, "porózus üveg"                (SelectiSphere)

  21. AFFINITÁSI KÖLCSÖNHATÁSOK (IMMOBILIZED LIGAND AFFINITY TECHNIOUES) IMMUNOAFFINITY (immunosorption) LECTINS (glycoproteins, oligo-polysaccharides) HORMONES (receptors/carriers/antihormones) PROTEINS (enzymes, immunoglobulins) SUBSTRATES (cofactors, inhibitors, modulators) NUCLEIC ACID binding ligands (oligo(dT)cellulose) VÍRUS binding ligands PHENYL BORONATE binding (cis-diols) IMMOBILIZED METAL ION binding affinity DYE-LIGAND binding affinity - Cibacron Blue F3G-A - Malachit Green (A/T specific) - Phenol Red (G/C specific)

  22. LECTINS FOR AFFINITY INTERACTIONS WITH GLYCOPROTEINS • With N-linked sugars • Lectin-AAA • Lectin-DSA • Lectin-GNA • Lectin-MAA • Lectin-SNA • Lectin-PHA-L • Specificity for structures • L-Fuc(l-6)GIcNAcl • Galβ(l-4)GlcNAc- • Man (l-3)62 Man- • SA (2-3)Gal • SA (2-6)Gal • Poly-Gal-GlcNAc- • With O-linked sugars • Lectin-ACA • Lectin-PNA • Lectin-ConA • Lectin-RCA-120 • Lectin-WGA SA(2-3)Galβ(l-3)-GalNAc-Ser/Thr Galβ(l-3) GalNAc-Ser/Thr

  23. AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA Ready-to-use group specific adsorbents

  24. Sejtmembrán glikoprotein (Na-deoxikolát extraktum) tisztítása L. culinaris lectin-Sepharose 4B oszlopon

  25. FESTÉK LIGANDUM AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA DYE-LIGAND AFFINITY CHROMATOGRAPHY

  26. DYE-LIGAND AFFINITY CHROMATOGRAPHY OF HUMAN SERUM PROTEINS • FUNCTIONAL GROUP: CIBACRON BLUE F3G-A • AFFINITY PACKING MATERIALS: • (Capacities  10 mg albumin per ml gel) • ~ Blue Sepharose CL-6B (Pharmacia) • ~ Affi-GelR Blue Gel           (Bio-Rad) • ~ Fractogel TSK AF-Blue (Merck), TOYOPEARL AF Blue HC-650M • COLUMN: 6x0.5cmI.D. (Pharmacia 5/5) • CHROMATOGRAPHIC SYSTEM: FPLC (Pharmacia) with LCC-500 Programmer and UV-1 Monitor (278 nm) • ELUTION: • Equilibrated and eluted with 10 mM phosphate buffer • pH: 5.8 or 6.8 • Step gradient elution with 10 mM phosphate buffer • pH:8.0 containing 2 M NaCl • FLOW RATE: 1 ml / min • SAMPLE: 500 μL ~ prepared by Sephadex G-25 • Equivalent to 50 μL of original serum

  27. DYE-LIGAND AFFINITY CHROMATOGRAPHY OF HUMAN SERUM PROTEINS COLUMN: Blue Sepharose CL-6B pH:5,8 Human serum samples prepared by Sephadex G-25

  28. FENIL BORONÁT AFFINITÁSI KROMATOGRÁFIA

  29. PSEUDO-URIDIN MEGHATÁROZÁSA HUMÁN VIZELETBEN

  30. PSEUDO-URIDINE DETERMINATION • PRINCIPLE • NUCLEOSIDES (PSEUDO-URIDINE) WITH VICINAL HYDROXYL GROUPS IN THEIR STRUCTURE CAN BE EXTRACTED SELECTIVELY BY AFFINITY CHROMA-TOGRAPHY FROM COMPLEX BIOLOGICAL SAMPLES AND SEPARATED BY REVERSED-PHASE HPLC. • SAMPLE PREPARATION • MICRO-PREPARATIVE BORONATE AFFINITY COLUMN (Affi-Gel 601, Bio-Rad Labs, 5x50 mm) WAS EQULIBRATED WITH 0.25M NH4-ACETATE (pH 8-8). ONE ml URINE WAS MIXED WITH 0.3 ml 2.5M NH4-ACETATE (pH 9.5) AND CENTRIFUGED. 500 μL SUPERNATANT WAS APPLIED ON THE AFFINITY • COLUMN AND WASHED WITH 2x4 ml 0.25M NH 4 - ACETATE (pH 8.8). ELUTION WAS PERFORMED WITH 5 ml 0.1M FORMIC ACID. ELUATE WAS COLLECTED AND FREEZE-DRYED. THE RESIDUE WAS SOLVED IN 250 μL 10mM NH4~PHOSPHATE (pH 5) CONTAINING 2 % METHANOL. • HPLC ANALYSIS • HP 1084B LIQUID CHROMATOGRAPH ISOCRATIC ELUTION WITH 10mM PHOSPHATE BUFFER (pH 5.1) CONTAINING 2% (v/v) METHANOL., • COLUMN: ODS-HYPERSIL (25x0.46 cm, 5u) TEMP: 35°C. FLOW: 1 ml/min. • DETECTION: 254 nm.

More Related