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Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana. Marcelo Ferreira Fernandes. Resumo. Parte I. Ecologia Microbiana Parte II. Diversidade Genética, Estrutural e da Composição Química de Lipídios em Microrganismos
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Cromatografia Gasosa de Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana Marcelo Ferreira Fernandes
Resumo • Parte I. Ecologia Microbiana • Parte II. Diversidade Genética, Estrutural e da Composição Química de Lipídios em Microrganismos • Parte III. Lipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana
Ecologia Microbiana • Objetivos: • Entender a biodiversidade de microrganismos na natureza e como diferentes guildas interagem em comunidades microbianas • Medir a atividade dos microrganismos na natureza e monitorar seus efeitos sobre o ecossistema (componentes bióticos e abióticos)
Interações entre Microrganismos e Impactos Ambientais e Econômicos Derivados de suas Atividades
O Exemplo do Ciclo do Nitrogênio N2 (80% atmosfera) N N
Outros Exemplos de Impactos Ambientais e Econômicos Derivados da Atividade de Microrganismos
Controle da disponibilidade de nutrientes minerais para as plantas • Ciclagem de nutrientes, associações simbióticas (FBN, micorrizas), perdas de nutrientes • Seqüestro de carbono e balanço de gases de efeito estufa • Melhoria da qualidade física e química do solo • Formação de húmus, formação e estabilização de agregados de solo • Controle biológico de pragas e doenças vegetais e animais • Processos infecciosos (doenças) em plantas e animais • Decomposição de alimentos e outros bens • Biolixiviação de minerais de importância econômica (cobre, ouro, urânio...) • Biorremediação de xenobióticos (pesticidas, petróleo, explosivos, nylon...) • Tratamento de águas; eutroficação de águas e poluição de lençóis freáticos • Corrosão de metais, entupimento de tubulações de água e óleo • Produção de enzimas de importância industrial, fármacos, combustíveis, polímeros para plásticos biodegradáveis etc • ...
Fatores que Controlam Estes Processos e Impactos • Bióticos • Presença e atividade de uma guilda específica • Interações entre guildas • Abióticas
A Atividade do “Fator Biótico” Visa à Sobrevivência • Obtenção de energia ou de compostos para síntese celular • Ciclos biogeoquímicos (C, N, P, S, Fe, Mn, Hg...) • Associações simbióticas com plantas e animais • Patógenos, predadores e parasitas • Transformação de compostos tóxicos ao crescimento microbiano • Ciclos biogeoquímicos • Proteção contra fatores ambientais adversos • ...
Diversidade Metabólica Microbiana • Vasta diversidade de “modos de vida” ou de conseguir recursos para sobrevivência • Entre espécies de microrganismos • Dentro da mesma espécie
Obtenção de Energia (Aerobiose) • Corg → CO2 (Fungos, bactérias, protozoários...) • Decomposição de restos animais e vegetais • Formação do solo (CO2 + H2O H2CO3), formação de humus, ciclagem de nutrientes • NH4+ → N2O → NO → NO3- (Nitrosomonas, Nitrobacter...) • Contaminação de águas com NO3- • Gases de efeito estufa • Fe2+ → Fe3+ (Thiobacillus ferroxidans) • Biolixiviação de metais (cobre, ouro, urânio...) • CH4 + 2 O2 → CO2 + 2 H2O • Importante dreno de metano • So + H2O + 1 ½ O2 → SO42- + 2 H+ (Thiobacillus, Beggiatoa...) • Solubilização de fosfatos de rocha pela acidificação do solo, corrosão de estruturas metálicas... • 2 H2 + O2 → 2H2O (Alcaligenes, Ralstonia...) • CO + ½ O2 → CO2 (carboxidotróficas: Pseudomonas carboxydovorans) • Principal dreno de monóxido de carbono da Terra
Obtenção de Energia (Anaerobiose: Aceptores de Elétrons) • CO2 → CH4 (Arqueas metanogênicas: Methanobacterium, Methanococcus) • Gás de efeito estufa e combustível • NO3- → NO → N2O → N2 (Alcaligenes, Pseudomonas...) • Perda de fertilizantes • Gases de efeito estufa • Fe3+ → Fe2+ (Geobacter, Shewanella, Geospirillum, Thiobacillus ferroxidans, Sulfolobus...) • Degradação de compostos aromáticos (benzoato, toleno) utilizados como fonte de energia (doadores de elétrons) • Biolixiviação de metais de sulfetos metálicos. • SO42- + acetato ou H2 → H2S (Desulfovibrio, Desulfobacter...) • Toxidez à vida aquática • Desclorinação redutiva de pesticidas clorados
Obtenção de Compostos para Síntese e Metabolismo Celulares • Fotoautotrofia (algas, cianobactérias, Euglena) • Fixação de CO2, via luz • Quimoautotrofia (muitas bactérias e arqueas) • Fixação de CO2, via oxidação de compostos minerais • Heterotrofia (fungos, protozoários, bactérias, arqueas) • C orgânico (saprofitismo, simbiose, parasitismo ou predação) • Fixação Biológica doN2 (algumas bactérias) • N2 NH4+ • ... • ... Dinitrogenase
Interações entre Guildas Microbianas • Rizóbios (fixadores simbióticos de N2) vs. actinomicetos (produtores de antibióticos) → controle do processo da FBN em soja • Fermentadores (diversos mcgs) vs. metanogênicos (arqueas anaeróbicas) vs. metanotróficos (bactérias anaeróbicas): balanço de metano entre solo e atmosfera → controle do processo de efeito estufa • CO2 CH4 H2
Fatores Abióticos de Controle da Atividade, Biomassa e Composição de Comunidades Microbianas
Atividade, Biomassa e Composição Microbianas são Afetadas por: • Disponibilidade de oxigênio • De modo geral, bactérias e arqueas mais versáteis que eucariotos • Disponibilidade de água • Fungos e actinomicetos mais resistentes a seca • Holoarqueas = extremófilos Temperatura • Extremófilos = poucas bactérias; ultra-extremófilos = muitas arqueas • Disponibilidade de nutrientes • Oligotróficos vs. copiotróficos • Disponibilidade de energia • pH • Fungos = ácido; bactérias = neutro (Extremos em Arquea e Bacterias) • Toxidez por produtos naturais e artificiais • Interações biológicas...
Impactos Antropogênicos sobre a Microbiota e Processos Associados • Preparo do solo: • aeração, temperatura, umidade, pH • Pesticidas e outros compostos químicos: • toxidez seletiva ou geral • Culturas, sistemas de culturas, mudanças de uso da terra • quantidade e qualidade de substrato, relações hospedeiro e microrganismos, temperatura e umidade • Adubações e calagem: • disponibilidade de nutrientes, pH... • Irrigação e drenagem: • disponibilidade de água, temperatura e oxigênio... • Pecuária: • disponibilidade de nutrientes, oxigênio... • Deposições atmosféricas industriais: • disponibilidade de nutrientes, pH...
Exemplos de Impactos de Atividades Humanas sobre a Atividade, Biomassa e Composição das Comunidades Microbianas
Mudança do Uso da Terra • Substituição de florestas por pastagens: • Pisoteio animal → compactação do solo → reduz fluxo de oxigênio para o solo • Ambiente aeróbico → anaeróbico • Favorecimento de metanogênicos em detrimento de metanotróficos • Aumento da emissão de CH4 para a atmosfera • Remoção da cobertura vegetal → maior incidência solar → dessecamento da superfície do solo • Limitação de água na superfície, mas não no subsolo • Menor atividade de metanotróficos • Aumento da emissão de CH4 para a atmosfera
Ecologia Microbiana Atividades Humanas Meio Ambiente Atividades Microbianas
PARTE IIDiversidade Genética, Estrutural e da Composição Química de Lipídios em Microrganismos
De Onde Vem a Capacidade dos Microrganismos de Realizar Tantas Funções e de se Adaptar a Tantos Ambientes Distintos?
Diversidade Genética • “Alta diversidade de genes” • Diversidade metabólica potencial determinada pelos genes de cada espécie. • Evolução cria novos genes a partir de outros existentes • Acúmulo de genes diferentes do ancestral: nova sps. • Taxonomia molecular baseada em similaridade nas seqüências de genes • Seqüências rRNA (Woese, 1990) • Três domínios muito distintos • Bacteria • Archea • Eukarya
Evolução, estruturas celulares e composições de macromoléculas • Além de gerar diversidade metabólica, a evolução genética resultou em diferenças marcantes em estruturas celulares e composições de macromoléculas entre grupos taxonômicos de microganismos: • Ex: parede celular e estrutura química dos lipídios
Estruturas Celulares Microbianas Ricas em Lipídios Bactérias Gram + Bactérias Gram - MP* MP* PC (Peptidoglicano) Peptidoglicano Membrana Externa* PC Fungos e Algas Protozoários MP* MP* PC (Fungos: Quitina) (Algas: Celulose, glicoproteínas)
Estruturas Celulares Microbianas Ricas em Lipídios (cont.) Achaea MP* PC (Pseudpeptidoglicano ou glicoproteínas ou proteínas ou polissacarídeos)
PARTE IIILipídios como Ferramenta para Estudos de Ecologia Microbiana
Ecologia Microbiana Aspectos de Interesse • Biomassa microbiana • Atividade microbiana • Composição ou estrutura da comunidade
Métodos para Investigação da Estrutura da Comunidade Microbiana • Dependentes de cultivo • Meios seletivos para organismos de interesse • Plaqueamento da amostra em meio de cultura sólido • Enumeração e identificação de microrganismos
Organismos Cultiváveis Fungos Actinomicetos Protozoários, Algas Archaea Bactéria
Organismos Viáveis, Não-Cultiváveis • Torsvik, V. et al. High Diversity in DNA of Soil Bacteria. Applied and Environmental Microbiology, 56(3):782-787, 1990. • Apenas 1 a 10% dos microrganismos na natureza são cultiváveis em laboratório; • Embora não cultiváveis, esses organismos são ativos na natureza; • Exemplos de impacto: • Morris et al. (Nature, 2002): • SAR 11, ser vivo mais abundante do planeta, não-cultivável. • Nitrificação: • Bactérias Nitrosomonas e Nitrobacter (Winogradsky, 1888) • Wuchter et al. (PNAS, 2006): • Archaea (Crenarchaeota): 100-1000 x mais abundante que bactérias nos oceanos • Leininger et al. (Nature, 2006): • Archaea (Crenarchaeota): ~3000x mais abundante que bactérias no solo
Métodos de Investigação da Comunidade Microbiana Independentes de Cultivo
Métodos Independentes de Cultivo • DNA • taxons e funções mais específicos • Primers específicos para grupos taxonômicos microbianos (rRNA) ou genes para enzimas relacionadas a uma determinada função (ex: bactérias nitrificantes = gene amo...) • Lipídios • em geral, compara grandes grupos taxonômicos de microrganismos • poucos marcadores para grupos funcionais específicos • em alguns casos, atividade de guilda com uma função específica pode ser investigada em associação com técnicas isotópicas • Marcador fenotípico
Métodos Baseados em DNA (opcional) • Extração do DNA da amostra ambiental • Amplificação de regiões específicas do DNA (PCR e primers específicos) • Taxonomia (rRNA) • Funções (genes específicos) • Padrão de bandas em gel de eletroforese • DGGE • LH-PCR • T-RFLP ... • Clonagem e seqüenciamento de fragmentos amplificados ou recuperados das bandas do gel • Identificação microbiana utilizando-se ferramentas de comparação de similaridades entre seqüências obtidas com as disponíveis em bancos de dados de seqüências de DNA (NCBI)
Métodos Baseados em Lipídios • Princípio de avaliação da estrutura das comunidades microbianas: • Diversidade Estrutural de Ácidos Graxos • Associação entre estrutura e grupos microbianos (biomarcadores microbianos) • Inferências sobre mudanças na estrutura da comunidade a partir de mudanças no perfil de ácidos graxos
Diversidade Química de Ácidos Microbianos ex: 18:26c Saturado (ex: 17:0) ex: 18:36c Poliinsaturado Monoinsaturado (ex: 18:19c) Ramificado(iso, iX:0) Ramificado(anteiso; aX:0) Ciclopropeno (ex: 19:0cy8c)
Nomenclatura dos Ácidos Graxos • X:Y • X = no de carbonos da molécula • Y = no de insaturações (duplas ligações) Ex: 16:0 (ácido hexadecanóico) • Se Y>0 (insaturados): • X:YZc, onde Z é a posição da primeira insaturação à partir do C distal, e “c” indica a conformação “cis”, e t, a “trans” Ex: 16:15c; 18:17t; 18:26c • iX:Y, aX:Y, X:Y 10-Me • Radical metil lateral na posição 2, 3 ou 10, a partir do C distal Ex: i15:0; a15:0; i17:0; 18:0 10-Me • X:Ycy Zc • cy representa presença de anel ciclopropeno Ex: 19:0cy 8c
Ácidos Graxos Biomarcadores • Grupos Taxonômicos • Poucos de Grupos Funcionais Específicos
Tipo FAME Grupo Microbiano Poliinsaturados 18:2ω6c Fungos Poliinsaturado 20:5ω6c Fungos micorrízicos arbusculares Poliinsaturado 20:4ω6c Protozoários, nematóides Metil C ω10 16:0 10Me; 17:0 10Me; 18:0 10Me Actinomicetos Metil C ω10 16:0 10Me Desulfobacter (redutoras do SO42-) Ciclopropil 17:0cy; 19:0cy Bactéria Gram negativas Iso/anteiso i15:0; a15:0; i16:0; i17:0, i17:0 Bactéria Gram positivas Monoinsaturado 18:1ω7c Bactéria Gram negativas Monoinsaturado 16:1ω5c (NLFA) Fungos micorrízicos arbusculares Monoinsaturado 16:1ω5c (PLFA) FMA, Flavobacterium/ Cytophaga Monoinsaturado ω8c 16:1ω8c, 18:1ω8c Bactérias metanotróficas Misto i17:1ω7c Desulfovibrio (redutoras do SO42-) Biomarcadores
Ácidos Graxos em Diferentes Classes de Lipídios Complexos • Ácidos graxos raramente ocorrem livres em células • Normalmente, eles integram lipídios estruturalmente mais complexos • Diferentes tipos de ligações químicas unem os ácidos graxos ao restante da molécula dos lipídios complexos
Ligações Químicas dos Ácidos Graxos • Lipídios com ligações éster • ex: triacilgliceróis • R-COO• • Lipídios com ligações éter • ex: plasmalógenos, Archaea • R-CH2O• • Lipídios com ligação amida • ex: esfingolipídios • R-CO • NH-R’
Éster Metílico de Ácido Graxo “Fatty Acid Methyl Ester”(FAME) Ácido Graxo R COOH Metanólise Alcalina Branda (PLFA e EL-FAME) ou Saponificação –Metanólise Ácida (MIDI) FAME Altamente volátil COOCH3