METODOLOGIAS PARA OBTENÇÃO DE BIOMASSA E EXTRAÇÃO DE LIPÍDEOS DE MICROALGAS MARINHAS

1. METODOLOGIAS PARA OBTENÇÃO DE BIOMASSA E EXTRAÇÃO DE LIPÍDEOS DE MICROALGAS MARINHAS Diniara Soares, Alexandre Guilherme Becker, Luiz Fernando de Lima Luz Júnior, André Bellin Mariano, José Viriato Coelho Vargas, Miguel Daniel Noseda, David Alexander Mitchell DiniaraSoares – diniara@yahoo.com.br Universidade Federal do Paraná Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular Curitiba, Agosto de 2009

2. Energia Renovável • As reservas mundiais de combustíveis fósseis são limitadas; • Desastres ambientais estão mais frequentes, devido aos desmatamentos e emissão de gases poluentes; • Governos mundiais estão apoiando o desenvolvimento de tecnologias renováveis • As microalgas são fonte de ENERGIA RENOVÁVEL

3. Microalgas • Microalgas são organismos unicelulares com rápido crescimento e com capacidade de realizar fotossíntese

4. Aplicações das microalgas • Suplemento alimentar • Carotenóides, pigmentos, omega-3, omega-6, antioxidantes; • Sequestro de CO2 • Biorremediação • Cosméticos • Aquicultura • Aplicações farmacêuticas • Produção de biocombustíveis

5. Microalgas  vegetais superiores • Vantagens das microalgas: • Consumo de água menor; • Crescem em água doce, água do mar e salobra (imprópria para agricultura); • O sistema de cultivo pode ser construído em solo não arável (regiões desérticas); • A produção da biomassa de microalga pode ser combinada com fixação direta de CO2; • Produz o ano inteiro (não têm safra); • Maior rendimento por área ocupada, 10  maior que uma oleaginosa de boa produtividade; Atualmente a maior parte dos biocombustíveis são produzidos por vegetais superiores Outras matérias-primas renováveis estão sendo estudadas para suprir necessidades futuras  MICROALGAS FONTE: CHISTI, 2007

6. Dificuldades na produção de microalgas • Cepas com alta produtividade de biomassa e lipídeos; • Susceptibilidade à contaminação biológica; • Adaptação ao ambiente; • Alto custo de processamento; • Avaliação dos processos Reduzir custos

7. Sistemas de produção em grande escala • Sistemas abertos - Lagoas Petroalgae, Melbourne,USA Cyanotech Inc. Hawaii

8. Sistemas de produção em grande escala • Sistemas fechados - Fotobiorreatores Algaelink, Netherland, Europa Sapphire energy, USA MIT Photobioreator, USA

9. Etapas do processo • Obtenção de biomassa • Inoculação • Crescimento  controle • Colheita  floculação, centrifugação, filtração • Secagem  Spray-dryer, estufa, fluxo de ar, liofilizador Área = 440.000 m2 Volumes grandes – Escala industrial ???? 1L – apenas 0,1 a 1% de biomassa seca 10.000 L – 10 a 100 kg de biomassa Earthrise, Ca

10. Obtenção da biomassa Recovery of microalgal biomass and metabolites: process and economics (GRIMA et al.,2003). • Spray-dryer  produtos de alto valor agregado ( $1000 ton-1) • Liofilização é muito cara  escala laboratorial • Filtração  depende do tamanho das células • Centrifugação  é uma boa opção, mas para volumes muito grandes pode ter uma alto custo de energia • Floculação  é o método mais barato • IDEAL – FLOCULAÇÃO seguida de CENTRIFUGAÇÃO Redução10% Meio de cultura 10.000 L Biomassa floculada 1.000 L Biomassa centrifugada 100 kg Floculação Centrifugação

11. Contribuir com o projeto do NPDEAS Objetivo Produção de biodiesel a partir de microalgas Construção de um fotobiorreator em escala piloto Financiamentos: CNPq e Nilko Geração de energia a partir do biodiesel produzido.

12. NPDEAS – Universidade Federal do Paraná Curitiba – PR, Brasil Projeto NPDEAS Construção em andamento • Fotobiorreator  tubular horizontal, construído em módulos com tubos transparentes de PVC • Estrutura: produção do inóculo  produção de biodiesel  geração de energia • Espaço físico: • Cepário • Laboratórios • Salas de aulas

13. Produção de Energia Auto-Sustentável Floculação Centrifugação SEPARAÇÃO

14. Floculação CENTRIFUGAÇÃO

15. Objetivo • Avaliar o efeito da floculação seguida de centrifugação de microalgas marinhas • Verificar o efeito da lavagem da biomassa • Definir uma metodologia adequada para determinar o teor de lipídeos totais da biomassa seca Não foi encontrado na literatura o efeito, na recuperação de biomassa e lipídeos, causado pela floculação das microalgas marinhas Microalgas marinhas possuem em seu meio de cultura sal, parte destes sais podem permanecer nas células mesmo após centrifugação Em escala laboratorial a produção de biomassa é muito pequena (escala de µg)

16. Material e Métodos • Microalgas • Phaeodactylumtricornutum • Nannochloropsisoculata • Cultura • GIA(Grupo Integrado de Aquicultura e Estudos Ambientais) UFPR, Curitiba – PR Temperatura: 20° C Meio: Guillard F/2 • Condições: Salinidade: 15 %0 Fotoperíodo: 24 h Aeração: constante

17. Obtenção da Biomassa • Centrifugação: Centrífuga 3340  g 20 min, 4 °C Congelador Liofilizador Biomassa seca Gravimetria mg L-1 100 mL

18. Obtenção da Biomassa • Floculação: • Remoção da capacidade de as células serem mantidas em suspensão e/ou estimulação da agregação das células, formando flocos que podem decantar; • Espontânea – biofloculação; • Induzida – produtos químicos, alteração de pH e eletrofloculação;

19. Obtenção da Biomassa • Floculação: pH = 10,3 Floculação com NaOH (1 M) 30 min 5 mL/L Centrífuga pH = 6,3 100 mL pH = 8,6 Floculação com FeCl3.6H2O (0,3 M) 1 mL/L

20. Tratamento da Biomassa • Lavagem após centrifugação: • sem lavar; • lavagem com água destilada; • lavagem com NH4HCO3 (0,5 M); • lavagem com NaCl (0,15 M); Centrífuga 3340  g 20 min, 4 °C Congelador Liofilizador 100 mL de solução de lavagem Centrífuga 3340  g 20 min, 4 °C Biomassa seca Gravimetria mg L-1

21. LIPÍDEOS TOTAIS BLIGH E DYER

22. Extração e Determinação do Teor Total de Lipídeos • Metodologia adequada para analisar quantidades pequenas (µg) de amostra; • Metodologias: uso de mistura monofásica de clorofórmio e metanol • Adaptação do método de Bligh e Dyer (1959) • Proporção de (CHCl3/CH3OH; 1/2, v/v) • Proporção de (CHCl3/CH3OH; 2/1, v/v) • Adaptação do método de Folchet al. (1957) • Proporção de (CHCl3/CH3OH; 2/1, v/v)

23. Resultados e Discussão – Lipídeos totais Teor total de lipídeos (em % de biomassa seca) extraídos por diferentes metodologias. Os valores são médias das amostras em triplicata seguidas do erro padrão das médias, * (p  0,05, teste T). Metodologia escolhida

24. Efeito dos tratamentos Teor total de lipídeos em relação à biomassa seca (%) e em relação ao volume de meio de cultura (mg L-1) da Phaeodactylumtricornutum. Tratamentos das amostras: (L-0) Sem lavar; (L-H2O) lavada com água destilada; (L-NH4CO3) lavada com bicarbonato de amônio 0,5 M; (L-NaCl) lavada com cloreto de sódio 0,15 M; (F-0) sem flocular; (F-NaOH) floculada com hidróxido de sódio 1 M; (F-FeCl3) floculada com cloreto férrico hexahidratado 0,3 M. Comparação das amostras pelo teste T: (a) efeito da floculação em relação às amostras não floculadas; (b) efeito da lavagem em relação às amostras não lavadas; (*;p  0,05) houve diferença significativa entre os resultados comparados; (ns; p  0,05) não houve diferença significativa entre os resultados comparados.

25. Influência dos tratamentos na biomassa seca Teor de biomassa seca (mg L-1) obtida a partir de microalgas submetidas a diferentes tratamentos de separação e lavagem. As barras verticaisrepresentam o erropadrão (n =3). Efeito da lavagem Efeito da floculação * * * * * * * * * * * * * (*; p  0,05) houve diferença significativa entre os resultados comparados (*; p  0,05) houve diferença significativa entre os resultados comparados

26. Influência dos tratamentos no teor total de lipídeos Teor de lipídeos totais (mg L-1) de microalgas submetidas a diferentes tratamentos de separação e lavagem. As barras verticais representam o erro padrão (n =3). Efeito da floculação Efeito da lavagem * * * (*; p  0,05) houve diferença significativa entre os resultados comparados (*; p  0,05) houve diferença significativa entre os resultados comparados

27. Conclusões • A floculação com NaOH não alterou significativamente (p  0,05) o teor lipídico total em relação ao volume de meio de cultura processado (mg L-1); • O processo de lavagem também não influenciou no teor lipídico utilizando floculação com NaOH, mas: • (a) reduz o volume de biomassa a ser processado (eliminação de contaminantes); • (b) pode reduzir a quantidade de sais originários do meio de cultura, os quais podem comprometer o maquinário; • A solução floculante de NaOH (1M) foi considerada uma boa alternativa para reduzir o volume de meio de cultura. O custo para a floculação de um mesmo volume de meio de cultura utilizando o agente floculanteNaOH é 60% mais barato do que quando utilizado o agente floculante FeCl3.6H2O;

28. Conclusões • No experimento realizado por Horiuchiet al. (2003), o meio de cultura clarificado após floculação com NaOH foi reutilizado adicionando-se solução de HCl para ajustar o pH. Após clarificação, nenhum inóculo foi empregado, mas as células remanescentes voltaram a se multiplicar após neutralização do meio. Este resultado sugere que as células após floculação não foram seriamente danificadas pelo tratamento alcalino; A colheita de células de microalgas proposta neste trabalho tem várias vantagens, incluindo alta recuperação de células, simplicidade operacional, baixo custo e reutilização do caldo clarificado

29. Agradecimentos