L’immunofenotipo leucocitario: utilità diagnostica

1. L’immunofenotipo leucocitario: utilità diagnostica Roberto Caporale Pistoia, 29 ottobre 2011

2. Bernard Shoor & Leonard Herzenberg at Stanford with one of the original BD Flow Cytometers 1974 - Becton & Dickson, using FACS technology, introduced 1st commercial Flow (FACS-1)

3. Sistema FACSCanto II BD Biosciences

4. Microscopia Citometria in fluorescenza

5. Citometria a Flusso (CFM) La CFM consente l’analisi automatica di sospensioni cellulari monodisperse, misurandone le caratteristiche fisiche e/o biochimiche all’interno di un flusso laminare che interseca unasorgente di eccitazione

6. FOCALIZZAZIONEIDRODINAMICA LASER sheath fluid campione

7. Rifrazione & Riflessione:proporzionale alla granularità cellulare e alla complessità rilevate a 90° rispetto la luce incidente. Generazione dei segnali di “scatter” SSC GRANULOCITI MONOCITI FSC Diffrazione: proporzionale alle dimensioni della cellula rilevata lungo l’asse della luce incidente 0° LINFOCITI

8. La combinazione dei due tipi di segnali permette di ottenere un particolare diagramma di dispersione denominatoCITOGRAMMAnel quale si possono evidenziare fino a 5 o 6 differenti popolazioni cellulari, in base alle sole caratteristiche fisiche

9. EOSINOFILI EOSINOFILI NEUTROFILI NEUTROFILI NEUTROFILI MONOCITI MONOCITI MONOCITI MONOCITI LINFOCITI LINFOCITI LINFOCITI LINFOCITI LINFOCITI BASOFILI Sottopopolazioni leucocitarie in sangue periferico -Citogramma - COMPLESSITA’  VOLUME 

11. Immunofenotipizzazionecellulare - definizione - Insieme di metodi diretti al riconoscimento, alla quantificazione ed alla localizzazione di strutture cellulari per mezzo di reagenti immunologici (anticorpi monoclonali).

12. 1st Pubblicazioni 123328 references (2010) Crescita delle applicazioni diagnostiche in citometria a flusso

13. Requisiti per una buona analisi citometrica • Esperienza dell’operatore • Valutazione delle prestazioni e della stabilità della strumentazione • Controlli di qualità (IQC, VEQ, EQAS)

14. Riproducibilità dei parametri di fluorescenza Linfoma Follicolare - diagnosi Linfoma Follicolare - MMR

15. Materiali idonei per indagini in CFM • Liquidi: • Sangue periferico • Aspirati Midollari • Leucaferesi • Liquor • Liquidi cavitari • Solidi: • Linfonodi • Biopsie • Agoaspirati

16. Regole per una corretta analisi citometrica in onco-ematologia • Quesito diagnostico (dialogo con i clinici) • Caratteristiche del campione da analizzare • Scelta di adeguate combinazioni di anticorpi monoclonali • Regolazione dello strumento e “compensazione” delle fluorescenze • Strategie di “gating” per il riconoscimento delle popolazioni cellulari da analizzare • Integrazione con i laboratori di morfologia, citogenetica e biologia molecolare • Formulazione di una risposta adeguata e conclusiva

17. Metodo di studio in citometria • Valutazione delle normali componenti cellulari del sangue midollare • Valutazione dello stadio maturativo di tali componenti • Dimostrazione della presenza nel campione di cellule anormali • Eventuale dimostrazione della loro clonalità • Evidenziazione di fenotipi peculiari allo scopo di identificare una determinata entità nosografica e/o utili per lasciare una traccia in corso di follow-up (MMR)

18. Espressione del CD45 nei leucociti

19. Sangue periferico Sangue midollare Sangue Periferico vs Sangue Midollare

20. Maturazione Mieloide: SIDE SCATTER

21. CD34 CD13 CD33 CD66c CD66b CD11c CD11b CD11a CD16 CD64 CD15 MATURAZIONE MIELOIDE:granulocitopoiesi stem cell Blasto mieloide promielocita Mielo cita Meta mielocita granulo cita

22. CD34 CD13 CD33 CD36 CD64 CD11b CD14 MATURAZIONE MIELOIDE monocitopoiesi stem cell Blasto mieloide promonocita Mono cita

23. CD11b CD13 CD16 CD10 CD64 MATURAZIONE MIELOIDE: variabili di espressione 100 0 PROMIELO MIELO METAMIELO GRAN

24. Maturazione Interpretazione suCD66b/CD11b

25. Maturazione Mieloide blocco maturativo blasti Interpretazione su CD66b/CD11b BM normale Sindrome mielodisplastica + mature immature

26. Maturazione mieloide in BM normale CD13 CD11b CD16 CD16 CD10 CD11b CD64 CD15

27. Maturazione mieloide in BM con MDS CD13 CD11b CD16 CD16 CD11b CD10 CD64 CD15

28. Maturazione mieloide in BM con MDS

29. Maturazione monocitaria in BM con LMMC

30. Mean values of bone marrow leucocyte populations Cell count 34.5 x 106 cell/ml (SD 28.0) Erythroid 10.8% (SD 5.7) Lymphocytes 12.4% (SD 5.9) CD3 61.4% (SD 15.1) CD4 29.3% (SD 11.3) CD8 30.8% (SD 13.1) NK 11.2% (SD 9.2) CD19 18.9% (SD 14.0) CD19+10+ 43.10% (SD28.6) CD19+20+ 45% (SD28.9) Monocytes (CD14) 3.2% (SD 1.5) CD34+ cells 0.9% (SD 0.7) Whole myeloid serie 72.2% (SD 8.7) Immature/blast 3.6% (SD 2.1) Promyelocytes 12.3% (SD 6.3) Myelo and metamyelo 28.4% (SD 11.4) band and mature 48.9% (SD 15.5) Eosinophils 1.9% (SD 1.5) Plasmacells 0.4% (SD 0.3) A. Santagostino

31. CD16 FITC/CD13 PE/CD34 PerCP-Cy5.5/ CD11b PE-Cy7/CD117 APC/CD45 APC-Cy7

32. Maturazione Mieloide: SIDE SCATTER NORMALE MDS

33. MDS ABNORMALITIES BY FCM • Hypogranulation of PMN 84% • CD11b/CD16 abnormal 70% • CD13/CD16 abnormal 78% • CD64+ granulocytes 66% • CD10- granulocytes 11% • CD45-dim blasts 53% • CD56+ granulocytes 21% • CD56+ monocytes 33% • My-cells expressing non-My Ags 38% Stetler-Stevenson, Blood 2001

34. CD16 FITC/CD13 PE/CD34 PerCP-Cy5.5/ CD11b PE-Cy7/CD56 APC/CD45 APC-Cy7

35. CD34 TdT nucleare CD79a citoplasmatico CD19 CD10 CD20 CD22 cµ citoplasmatico SmIg PROFILO ANTIGENCO Maturazione linfoide B stem cell Cellula pre-pre B Cellula pre B Cellula B

36. CD20 FITC/CD10 PE/CD34 PerCP-Cy5.5/ CD38 PE-Cy7/CD19 APC/CD45 APC-Cy7 Maturazione linfoide B

37. CD22 FITC/CD200 PE/ CD19 PerCP-Cy5.5 / CD5 PE-Cy7/ CD23 APC /CD45 APC-Cy7 Intensità di espressione nelle M. Linfoproliferative MCL CLL

38. Kappa FITC/Lambda PE/ CD20 PerCP-Cy5.5 / CD38 PE-Cy7/ CD19 APC /CD45 APC-Cy7 Intensità di espressione nelle M. Linfoproliferative MCL CLL

39. Presenza o assenza di marcatori nelle M. Linfoproliferative MCL CLL

40. Espressione di ZAP-70 nelle CLL

41. VALUTAZIONE HCL CD103 FITC/CD11c PE/ CD20 PerCP-Cy5.5 / CD25 PE-Cy7/ CD19 APC /CD45 APC-Cy7

42. VALUTAZIONE T-LDGL CD57 FITC/CD5 PE/ CD3 PerCP-Cy5.5 / HLA-DR PE-Cy7/ CD8 APC /CD45 APC-Cy7

43. ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI CD158a E CD158b SULLE CELLULE NKpattern atteso in una popolazione policlonale CD158b CD158a

44. ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI CD158a E CD158b SU CELLULE KIR+ pattern compatibili con l’ipotesi di clonalità CD158b CD158b CD158a CD158a CD158b CD158b CD158a CD158a

45. ANALISI BIVARIATA DELLA DISTRIBUZIONE DI CD158a E CD158b SULLE CELLULE NK pattern atteso in una popolazione policlonale pattern compatibili con l’ipotesi di clonalità

47. VALUTAZIONE PLASMACELLULE

48. Immunofenotipo plasmacellule normali

49. Immunofenotipo plasmacellule trasformate

50. Immunofenotipo plasmacellule trasformate • CD19-CD56- • CD19-CD56+