Spettroscopia UV-VIS di biomolecole: tecniche stazionarie e risolte in tempo

1. Spettroscopia UV-VIS di biomolecole: tecniche stazionarie e risolte in tempo Paolo Foggi

2. Argomenti introduttivi Interazione radiazione � materia Punto di vista classico Punto di vista quantistico Separazione dei moti molecolari Regole di selezione

3. Interazione radiazione-materia Qualsiasi corpo � costituito di cariche elettriche in movimento Un�onda elettromagnetica tende a modificare la posizione relativa delle cariche compiendo sul sistema un lavoro

4. L�onda elettromagnetica interagisce col sistema molecolare attraverso la sua parte magnetica ed elettrica Le energie in gioco sono molto diverse

5. Spettroscopie ottiche Interazione del campo elettrico con il momento di dipolo oscillante Massa degli elettroni molto pi� piccola della massa dei nuclei

6. Ancora modello classico L�energia trasferita dal campo al sistema pu� essere restituita se non sono presenti risonanze Oppure in presenza di risonanze viene assorbita Successivamente l�energia assorbita viene degradata per la presenza di processi dissipativi

7. La radiazione viene attenuata Spettroscopie in assorbimento Nuova radiazione viene prodotta dal sistema Spettroscopie in emissione

8. Aspetti quantistici L�energia non varia con continuit� ma per quanti hn L�equazione che regola il sistema � l�equazione di Schr�dinger In assenza di interazioni esterne H Y = EY Contiene tutte le interazioni fra le particelle

9. La soluzione esatta dell�equazione � possibile solamente in alcuni semplici sistemi (atomo di idrogeno, molecola ione idrogeno �) Per sistemi di maggior complessit� occorre separare i vari contributi e valutare singole equazioni (H1 +H2 +H3 ...)(Y1 Y2 Y3...) = (E1+E2+E3...) (Y1 Y2 Y3...)

10. Approssimazione di Born-Oppenhemer Separazione fra moti elettronici e nucleari I nuclei si muovono all�interno di un potenziale determinato dalle posizioni medie (non istantanee) degli elettroni Gli elettroni vedono i nuclei fermi H elYel = EelYel Si ottengono i livelli elettronici del sistema imperturbato

11. Teoria delle perturbazioni dipendenti dal tempo L�operatore Hamiltoniano H viene modificato per il contributo dovuto all�interazione del sistema molecolare col campo elettromagnetico Perturbazione Autofunzioni imperturbate

12. La forma di H� determina il tipo di interazione SPETTROSCOPIA L�elemento che determina l�intensit� dell�interazione � Regole di selezione

13. Approssimazione di dipolo: il termine che regola l�accoppiamento fra onda elettromagnetica e sistema molecolare � H � = m . E Affinch� vi sia trasferimento di energia Il momento di transizione

14. Regole di selezione Specifiche : dipendono dal tipo di momento di transizione Di simmetria : l�elemento di transizione � invariante rispetto a qualsiasi operazione di simmetria del sistema Restrizioni sulla simmetria degli stati coinvolti nel processo

15. Progressione costruita sui modi di vibrazione totalsimmetrici

16. Tipi di stati elettronici Dipendono dal tipo di legame Localizzati ?s Delocalizzati ? p Quando gli elettroni favoriscono l�avvicinamento dei nuclei si parla di stati di legame In caso contrario di antilegame (*) Inoltre stati di non-legame (N e O): n

17. Tipi di stati elettronici (spin) Ogni orbitale pu� contenere al massimo due elettroni con spin antiparallelo

18. In sistemi contenenti solamente atomi di C, N, O lo stato elettronico fondamentale � quasi sempre di singoletto = S (tutti gli orbitali sono occupati da coppie di elettroni) Nel caso di singoli elettroni spaiati (radicali) lo stato fondamentale � un doppietto = D Due elettroni spaiati ?Stato di tripletto = T In presenza di ioni metallici il numero di elettroni spaiati pu� essere ancora pi� alto.

19. Tipi di transizioni p?p* n?p* s?s* In molecole contenenti ioni metallici si possono avere inoltre transizioni fra orbitali atomici (d ? d) e Metallo ?Legante Legante ? Metallo

20. Transizioni localizzate Alcune strutture elettroniche sono localizzate in particolari porzioni del sistema molecolare Le transizioni elettroniche sono confinate in una regione ristretta e sono sensibili solamente a locali variazioni Si parla in generale di cromofori

21. Processi di rilassamento Uno stato reale del sistema � in grado di assorbire l�energia dell�onda elettromagnetica L�energia viene dissipata attraverso accoppiamenti con altri stati del sistema L�equilibrio si raggiunge

22. Processi di rilassamento

23. Aspetti sperimentali

24. Aspetti sperimentali

25. Applicazioni alle proteine Zone di assorbimento diverse 10-185 nm UV di vuoto 185-200 nm UV (legame peptidico) 200-300 nm UV medio (amino acidi aromatici) 300-400 nm vicino UV (gruppo eme) 400-700 nm VIS (gruppo eme) 700-2000 nm vicino IR (trasf.di carica)

28. Aminoacidi aromatici

30. Trasferimento di energia fra cromofori

32. Spettroscopia dei gruppi prostetici Si prende in esame il gruppo protoeme (complesso del Fe con la protoporfirina IX

34. Transizioni d?d isoenergetiche con le transizioni p ?p* del sistema porfirinico Questo comporta un mescolamento degli stati Gli spettri elettronici sono quindi sensibili allo stato di spin dello ione ferro Sono sensibili allo stato di ossidazione Sono sensibili alla posizione dei leganti assiali (al tipo alla distanza) che determinano lo stato di spin pi� stabile

35. Tecniche risolte in tempo Scopo: sondare le propriet� dinamiche e le variazioni strutturali direttamente nel tempo Scala temporale dei processi ampia: <100 fs (1 fs = 10-15 s) a >1s Si studiano sistemi transienti in stato fondamentale o eccitato

36. Per una misura risolta in tempo occorre conoscere con esattezza il tempo zero La precisione richiesta in una misura dipende dalla scala temporale che si vuole investigare Le sorgenti luminose di eccitazione sono pulsate. Quelle di sonda possono essere anche continue La durata di un impulso luminoso varia col tipo di sorgente: lampade flash fino a ns, laser con anche minori di 100 fs

37. Il diagramma di Jablonski

38. Diagramma per processi extramolecolari

39. Apparato sperimentale

41. Salto di Temperatura indotto da laser

42. Innesco ottico

43. Apparato sperimentalecon risoluzione =100 fs

49. Frammento 1-56 ferrico

50. Composto modello bis-istidinico

51. Conclusioni (confronto citocromo c frammento 1-56) Il processo iniziale che domina il rilassamento dopo l�eccitazione ottica � uno spin cross-over La diversa profondit� del potenziale attrattivo nelle forme alto e basso spin favorisce nel caso del complesso FeIII un rapido processo di conversione interna nel FeII il distacco del legante assiale Nel complesso bis-istidinico l�assenza di una struttura secondaria non favorisce la ricombinazione del complesso esacoordinato